2. Material and methods2.1. Study p

2. Material and methods

2.1. Study populations and specimens

All necessary permits to collect and transport abalone for research purposes were obtained from the Department of Agriculture, Forestry and Fisheries (Republic of South Africa). Ninety six F1 cultured ani- mals were collected from three aquaculture facilities, one from the west- (CPWC), south- (CPSC) and east- (CPEC) coast of South Africa (32 animals per facility). These animals were randomly selected, across spawning cohorts, in order to attain a representative sample of the total F1 population on each respective facility. Animals were aged between three and four years and had gone through the entire production system, including several grading procedures according to each facility's specifications.
Muscle and gill tissues were collected from each individual and placed in 70% ethanol and stored at − 20 °C until DNA extraction could be performed via the standard CTAB method (Saghai-Maroof et al., 1984). For comparison, 96 wild animals previously collected

from the west- (Saldanha Bay, WPWC), south- (Witsand, WPSC) and east- (Riet Point, WPEC) coast of South Africa (32 animals each) were also used (populations are described in Bester-van der Merwe et al., 2011). These populations represent the ancestral progenitor populations for each of the respective cultured populations corresponding to the geographic region.

2.2. Molecular marker development

Recently Franchini et al. (2011) developed a substantial EST resource for H. midae. To develop EST-microsatellite markers, contig sequences from this resource were imported into BatchPrimer ver- sion 3 software (You et al., 2008); this program then simultaneously searched for repeat sequences and designed primers for the PCR am- plification of the particular locus using default parameters. All repeat motifs from dinucleotides to hexanucleotides were included in the repeat search. A local BLASTn to an in-house microsatellite sequence database (containing all previously identified microsatellite se- quences) was conducted to prevent redundancy. Several PCR optimi- sation steps were taken using varying annealing temperatures and protocols, including: standard and touchdown PCR cycle programs with 1) Promega® goTaq PCR kit, 2) the Kapa2G™ PCR Kit and 3) the Springbok® Taq Kit. All reactions were performed in a total volume of 10 μl containing 20 ng DNA, 1× Buffer, 2 mM MgCl2,
0.2 mM dNTPs, 0.5 U Taq DNA polymerase (Supplementary Informa-
tion, Table S1). To test for polymorphism, polyacrylamide gel elec- trophoresis (12%, 40× cross-linkage at 150 V for 1 h30) was performed using a panel of eight randomly selected individuals. This was followed by bi-directional sequencing to validate the locus sequence. Primers were fluorescently labelled for loci that dem- onstrated polymorphism, with one of the following dyes: FAM, VIC, PET, NED (Applied Biosystems); to enable genotyping via capillary electrophoresis. For further analysis in the study populations, eight tetranucleotide EST-microsatellites were selected.

2.3. Population genetic analysis of study populations

To evaluate genetic diversity amongst the study populations, eight tetranucleotide genomic-microsatellites previously developed via the FIASCO protocol (Bester et al., 2004; Slabbert et al., 2008) and eight newly developed tetranucleotide EST-microsatellites were used. All PCR reactions were conducted in a final volume of 10 μl and according to the specifications of the authors, for previously developed markers, or as currently described for EST-markers. Allele scoring was done using GeneMapper® version 4 (Applied Biosystems). Tetranucleotide repeats are mutationally more stable and generally allows for easy and more reliable allele scoring. In addition, to minimise biases and in order to make direct comparisons between genomic and EST- microsatellites, similar repeat motifs were used across the molecular marker classes. Micro-checker version 2.2.3 (Van Oosterhout et al., 2004) was used to test for possible genotyping errors, and the pres- ence of null alleles (null allele estimates as per the method of Brookfield, 1996).
Hardy-Weinberg equilibrium (exact probability test, 500 batches, 10,000 iterations), expected and observed heterozygosity and locus specific Fis was calculated using Genepop version 4.0 (Rousset, 2008). The number of alleles and allelic richness was computed using FStat version 2.9.3.2 (Goudet, 1995) and a Kruskal–Wallis test was performed to evaluate significant differences in number of al- leles, allele richness and observed and expected heterozygosity amongst populations and molecular marker classes. Furthermore, the probability of linkage disequilibrium between all pairs of loci was calculated via an exact test using Genepop. Neutrality was tested using the Slatkin exact test (10,000 permutations) based on the Ewens sampling theory (Slatkin, 1994) in Arlequin version 3.5.1.2
(Excoffier and Lischer, 2010) as well as the Fst-outlier

Results (Thai) 1:

2. วัสดุและวิธีการ2.1. ศึกษาประชากรและตัวอย่างจำเป็นทั้งหมดที่อนุญาตให้เก็บรวบรวม และขนส่งหอยเป๋าฮื้อเพื่อการวิจัยได้รับมาจากกรมวิชาการเกษตร ป่าไม้ และประมง (สาธารณรัฐแอฟริกาใต้) ซิกซ์ F1 อ่างอย่าง ani-mals ถูกรวบรวมจากสิ่งสัตว์สาม หนึ่งจากตะวันตก- (CPWC), ใต้- (เพิ่ม) และตะวันออก- (CPEC) ชายฝั่งแอฟริกาใต้ (32 สัตว์ต่อสิ่งอำนวยความสะดวก) สัตว์เหล่านี้ถูกสุ่มเลือก ข้ามรุ่น การวางไข่เพื่อให้ได้ตัวอย่างตัวแทนของประชากร F1 ในแต่ละสถานที่นั้น ๆ สัตว์ที่มีอายุระหว่าง 3 และ 4 ปี และได้ผ่านระบบการผลิตทั้งหมด รวมถึงขั้นตอนคะแนนการวัดผลต่าง ๆ ตามข้อมูลของแต่ละสถานเนื้อเยื่อกล้ามเนื้อและปลาได้รวบรวมจากแต่ละบุคคล และในเอทานอล 70% และเก็บไว้ที่− 20 ° C จนกว่าสามารถทำการสกัดดีเอ็นเอ ด้วยวิธี CTAB มาตรฐาน (อุ Saghai et al. 1984) สำหรับการเปรียบเทียบ สัตว์ป่า 96 ก่อนหน้านี้รวบรวม จากตะวันตก (อ่าว Saldanha, WPWC), ใต้ (Witsand, WPSC) และตะวันออก- (จุด Riet, WPEC) ชายฝั่งแอฟริกาใต้ (32 สัตว์) ยังใช้ (ประชากรไว้ใน Bester van der Merwe et al. 2011) ประชากรเหล่านี้แสดงถึงประชากรของบรรพบุรุษสืบแต่ละประชากรอ่างเกี่ยวข้องสอดคล้องกับภูมิภาคทางภูมิศาสตร์2.2. โมเลกุลเครื่องหมายพัฒนาเมื่อเร็ว ๆ นี้ Franchini et al. (2011) พัฒนาทรัพยากร EST พบสำหรับ H. midae การพัฒนาเครื่องหมายชนิด microsatellite EST, contig ลำดับจากทรัพยากรนี้ถูกนำเข้าสู่ BatchPrimer ver-sion 3 ซอฟต์แวร์ (คุณ et al. 2008); โปรแกรมนี้แล้วพร้อมหาลำดับซ้ำ และออกแบบไพรเมอร์สำหรับ am plification PCR ของโลกัสโพลเฉพาะที่โดยใช้พารามิเตอร์การเริ่มต้น ทั้งหมดซ้ำลวดลายจาก dinucleotides เพื่อ hexanucleotides รวมอยู่ในการค้นหาซ้ำ BLASTn ท้องถิ่นกับฐานข้อมูลลำดับชนิด microsatellite ในบ้าน (ประกอบด้วยทั้งหมดก่อนหน้านี้ identified ชนิด microsatellite se-quences) ที่ดำเนินการเพื่อป้องกันความซ้ำซ้อน PCR หลายขั้นตอน optimi สามารถถ่ายโดยใช้ระดับอุณหภูมิการหลอมและโปรโตคอ รวมถึง: มาตรฐานและเก็บเหรียญ PCR วงจรโปรแกรมกับ 1) Promega® goTaq PCR kit, 2) Kapa2G™ PCR Kit และชุด 3 Taq® Springbok ปฏิกิริยาทั้งหมดดำเนินการในปริมาณรวมของที่ประกอบด้วยดีเอ็นเอ 20 ฉบับ 1 ×บัฟเฟอร์ 2 มม. MgCl2, μl 10dNTPs 0.2 mM, 0.5 U Taq DNA พอลิเมอเรส (เสริม Informa-ทางการค้า ตาราง S1) การทดสอบโพลิมอร์ฟิซึม เจ polyacrylamide ไฟฟ้าหนึ่ง-trophoresis (12% เชื่อมโยงข้าม 40 × 150 V สำหรับ 1 h30) ถูกดำเนินการโดยใช้แผงการเลือกสุ่มบุคคลแปด นี้ตามมา โดยลำดับสองทิศทางเพื่อตรวจสอบลำดับโลกัสโพล ไพรเมอร์ได้ fluorescently มีป้ายสำหรับ loci ที่ dem onstrated โพลิมอร์ฟิซึม กับสีต่อไปนี้อย่างใดอย่างหนึ่ง: FAM, VIC สัตว์ เลี้ยง NED (ใช้ศาสตร์เชิงชีวภาพ); การเปิดใช้งาน genotyping ผ่านอิฝอย สำหรับการวิเคราะห์เพิ่มเติมในประชากรศึกษา ได้เลือกแปด tetranucleotide EST microsatellites2.3. ประชากรวิเคราะห์พันธุกรรมของประชากรศึกษาการประเมินความหลากหลายทางพันธุกรรมในหมู่ประชากรศึกษา แปด tetranucleotide การ-microsatellites ก่อนหน้านี้พัฒนาผ่านโพรโทคอที่ล้มเหลว (Bester et al. 2004 Slabbert et al. 2008) และ tetranucleotide ใช้ EST microsatellites แปดที่พัฒนาขึ้นใหม่ ปฏิกิริยา PCR ทั้งหมดถูกดำเนินการในการพิจารณา ของ 10 μl และ ตามข้อมูลของผู้เขียน สำหรับเครื่องหมายพัฒนาก่อนหน้านี้ หรือในปัจจุบันอธิบายไว้สำหรับเครื่องหมาย EST ให้คะแนนลสามารถทำใช้ GeneMapper® รุ่น 4 (ใช้ศาสตร์เชิงชีวภาพ) ทำซ้ำ Tetranucleotide มี mutationally เพิ่มเติมเสถียร และโดยทั่วไปทำให้อัลลีลง่าย และเชื่อถือได้มากกว่าการให้คะแนน และนอกจาก นี้ เพื่อลดควรสั่งการเปรียบเทียบโดยตรงระหว่างการ และ EST-microsatellites คล้ายทำซ้ำลายใช้ข้ามชั้นโมเลกุลเครื่องหมาย ไมโครตรวจสอบเวอร์ชัน 2.2.3 (Van อินเทอร์เน็ต et al. 2004) ถูกใช้เพื่อทดสอบข้อผิดพลาดได้ genotyping และ ence เค้นของ alleles เป็น null (ว่างลสามารถประเมินตามวิธีการของ Brookfield, 1996)ฮาร์ดี-Weinberg สมดุล (ทดสอบความน่าเป็นที่แน่นอน 500 ชุด ซ้ำ 10,000), คาด และสังเกต specific heterozygosity และโลกัสโพล Fis คำนวณใช้ Genepop รุ่น 4.0 (Rousset, 2008) จำนวน alleles และร่ำรวย allelic ถูกคำนวณโดยใช้ FStat รุ่น 2.9.3.2 (Goudet, 1995) และการทดสอบ Kruskal – วาลเพื่อประเมินงมากความแตกต่างของอัล-leles ร่ำรวยลสามารถทำ และสังเกต และคาด heterozygosity ในหมู่ประชากรและเรียนเครื่องหมายโมเลกุล นอกจากนี้ น่า disequilibrium ความเชื่อมโยงระหว่างคู่ของ loci ถูกคำนวณผ่านการทดสอบที่แน่นอนโดยใช้ Genepop ทดสอบความเป็นกลางโดยใช้ Slatkin ทดสอบที่แน่นอน (10,000 วิธีเรียงสับเปลี่ยน) อิง Ewens ทฤษฎี (Slatkin, 1994) ในทุกรุ่น 3.5.1.2 การสุ่มตัวอย่าง(Excoffier และ Lischer, 2010) และ Fst-outlier

Results (Thai) 2:

2. วัสดุและวิธีการ2.1 ประชากรศึกษาและตัวอย่างใบอนุญาตที่จำเป็นทั้งหมดเพื่อรวบรวมและหอยเป๋าฮื้อการขนส่งเพื่อการวิจัยที่ได้รับจากกรมวิชาการเกษตรป่าไม้และประมง (สาธารณรัฐแอฟริกาใต้) เก้าสิบหก F1 Mals ani- เพาะเลี้ยงที่ถูกเก็บรวบรวมจากสามบ่อเลี้ยงสัตว์น้ำหนึ่งจาก West- (CPWC) เฉียงใต้ (CPSC) และ east- (CPEC) ชายฝั่งของแอฟริกาใต้ (32 สัตว์ต่อสิ่งอำนวยความสะดวก) สัตว์เหล่านี้ได้รับการคัดเลือกโดยการสุ่มข้ามผองวางไข่เพื่อให้บรรลุตัวอย่างที่เป็นตัวแทนของประชากร F1 รวมสิ่งอำนวยความสะดวกที่เกี่ยวข้องในแต่ละ สัตว์ที่ถูกที่มีอายุระหว่างสามและสี่ปีและได้ผ่านระบบการผลิตรวมทั้งขั้นตอนการจัดลำดับหลายตามแต่ละสถานที่ของไพเพอร์ระบุไว้. กล้ามเนื้อและเหงือกเนื้อเยื่อที่ถูกเก็บรวบรวมจากแต่ละบุคคลและวางอยู่ใน 70% เอทานอลและเก็บไว้ที่ - 20 องศาเซลเซียสจน สกัดดีเอ็นเอสามารถทำได้ผ่านมาตรฐาน CTAB วิธี (ซาไก-Maroof et al., 1984) สำหรับการเปรียบเทียบ 96 สัตว์ป่าเก็บมาก่อนหน้าจาก West- (Saldanha อ่าว WPWC) เฉียงใต้ (Witsand, WPSC) และ east- (Riet Point, WPEC) ชายฝั่งของแอฟริกาใต้ (32 สัตว์แต่ละ) นอกจากนี้ยังถูกนำมาใช้ (ประชากร อธิบายไว้ใน Bester-แวนเดอร์ Merwe et al. 2011) ประชากรเหล่านี้เป็นตัวแทนของประชากรรากเหง้าของบรรพบุรุษสำหรับแต่ละประชากรเพาะเลี้ยงนั้นสอดคล้องกับพื้นที่ทางภูมิศาสตร์. 2.2 การพัฒนาเครื่องหมายโมเลกุลเมื่อเร็ว ๆ นี้ Franchini et al, (2011) การพัฒนาทรัพยากร EST มากสำหรับเอช midae การพัฒนาเครื่องหมาย EST-ไมโครลำดับ contig จากทรัพยากรนี้ถูกนำเข้ามาใน BatchPrimer ver- Sion 3 ซอฟแวร์ (คุณ et al, 2008.); โปรแกรมนี้แล้วพร้อมกันค้นหาลำดับซ้ำและการออกแบบไพรเมอร์สำหรับ PCR Am- PLI Fi ไอออนบวกของสถานทีโดยเฉพาะอย่างยิ่งการใช้ค่าเริ่มต้น ทั้งหมดลวดลายซ้ำจาก dinucleotides เพื่อ hexanucleotides ถูกรวมอยู่ในการค้นหาซ้ำ ดังกล่าวหาท้องถิ่นเพื่อลำดับไมโครฐานข้อมูลในบ้าน (มีทั้งหมดระบุก่อนหน้านี้ไมโคร Fi เอ็ด quences ซีเอ็ด) ได้ดำเนินการเพื่อป้องกันไม่ให้ซ้ำซ้อน หลายขั้นตอนวิธี PCR optimi- sation ถูกนำมาใช้ที่แตกต่างกันอุณหภูมิการหลอมและโปรโตคอลรวมถึงมาตรฐานทัชดาวน์และโปรแกรมรอบ PCR กับ 1) ชุดPromega® goTaq PCR 2) ชุด Kapa2G ™ PCR และ 3) ชุดSpringbok® Taq ปฏิกิริยาทั้งหมดถูกดำเนินการในปริมาณรวมของ 10 ไมโครลิตรมี 20 ดีเอ็นเอ NG, 1 ×บัฟเฟอร์ 2 mm MgCl2, 0.2 มิลลิ dNTPs, 0.5 U Taq DNA Polymerase (เสริมข้อมูลที่การ, ตาราง S1) เพื่อทดสอบความแตกต่าง, polyacrylamide เจล trophoresis อิ (12%, 40 ×ข้ามการเชื่อมโยงที่ 150 V 1 H30) ได้ดำเนินการโดยใช้แผงแปดบุคคลที่เลือกสุ่ม นี้ตามมาด้วยสองทิศทางลำดับในการตรวจสอบลำดับสถานที ไพรเมอร์ที่ได้รับการติดป้ายชื่อ fl uorescently สำหรับตำแหน่งที่ dem- polymorphism onstrated กับหนึ่งในสีย้อมต่อไปนี้: FAM, VIC, PET, NED (Applied Biosystems); เพื่อเปิดใช้งานผ่านทางเส้นเลือดฝอย genotyping electrophoresis สำหรับการวิเคราะห์ต่อประชากรในการศึกษา, แปด tetranucleotide EST-ไมโครได้รับการคัดเลือก. 2.3 ประชากรการวิเคราะห์พันธุกรรมของประชากรการศึกษาเพื่อประเมินความหลากหลายทางพันธุกรรมในหมู่ประชากรการศึกษา, แปด tetranucleotide จีโนม-ไมโครพัฒนาก่อนหน้านี้ผ่านทางโปรโตคอลล้มเหลว (Bester et al, 2004;. Slabbert et al, 2008.) และแปดที่พัฒนาขึ้นใหม่ tetranucleotide EST-ไมโครได้ มือสอง ทั้งหมดปฏิกิริยา PCR ได้ดำเนินการในปริมาณ Fi NAL 10 ไมโครลิตรและเป็นไปตามไพเพอร์ระบุไว้ของผู้เขียนสำหรับการพัฒนาเครื่องหมายไว้ก่อนหน้านี้หรือตามที่อธิบายไว้ในขณะนี้สำหรับ EST-เครื่องหมาย ศาสตร์การให้คะแนนที่ได้กระทำโดยใช้GeneMapper®รุ่น 4 (Applied Biosystems) ซ้ำ Tetranucleotide มี mutationally มีเสถียรภาพมากขึ้นและโดยทั่วไปช่วยให้ง่ายและน่าเชื่อถือมากขึ้นอัลลีลคะแนน นอกจากนี้เพื่อลดอคติและเพื่อที่จะทำการเปรียบเทียบโดยตรงระหว่างจีโนมและไมโคร EST- ลวดลายซ้ำที่คล้ายกันถูกนำมาใช้ในการเรียนเครื่องหมายโมเลกุล รุ่น Micro-Checker 2.2.3 (Van Oosterhout et al., 2004) ถูกนำมาใช้ในการทดสอบสำหรับข้อผิดพลาด genotyping ที่เป็นไปได้และ ence ดันของอัลลีล null (ประมาณการอัลลีล null ตามวิธีการของบรูค ELD fi, 1996). Hardy-Weinberg สมดุล (ทดสอบที่แน่นอนน่าจะเป็น 500 สำหรับกระบวนการ 10,000 ซ้ำ) และคาดว่าจะสังเกต heterozygosity และสถานทีระบุไว้ C Fis ที่คำนวณได้ใช้รุ่น Genepop 4.0 (Rousset 2008) จำนวนอัลลีลและ allelic ความร่ำรวยที่ได้รับการคำนวณโดยใช้รุ่น fstat 2.9.3.2 (Goudet, 1995) และการทดสอบ Kruskal-Wallis ได้ดำเนินการในการประเมินความแตกต่าง Fi ลาดเทมีนัยสำคัญในจำนวนของ leles อัล, อัลลีลร่ำรวยและตั้งข้อสังเกตและคาดว่า heterozygosity ในหมู่ประชากรและโมเลกุล เรียนเครื่องหมาย นอกจากนี้น่าจะเป็นของเสียสมดุลการเชื่อมโยงระหว่างคู่ของตำแหน่งที่ถูกคำนวณได้ผ่านการทดสอบที่แน่นอนโดยใช้ Genepop เป็นกลางได้รับการทดสอบโดยใช้การทดสอบ Slatkin ที่แน่นอน (10,000 พีชคณิต) ตามทฤษฎีการสุ่มตัวอย่าง Ewens (Slatkin, 1994) ใน Arlequin รุ่น 3.5.1.2 (Excof Fi ER และ Lischer 2010) เช่นเดียวกับ Fst-ค่าผิดปกติ

Results (Thai) 3:

2 . วัสดุและวิธีการ2.1 . ประชากรศึกษาและตัวอย่างใบอนุญาตที่จำเป็นทั้งหมดเพื่อเก็บหอยและการขนส่งเพื่อการวิจัยได้จากกระทรวงเกษตร ป่าไม้ และประมง ( แอฟริกาใต้ ) เก้าสิบหก F1 เลี้ยงแอนี่ - มัล รวบรวมจากสามการเพาะเลี้ยงสัตว์น้ำเครื่องหนึ่งจากตะวันตก - ( cpwc ) , South - ( CPSC ) และตะวันออก - ( cpec ) ชายฝั่งของแอฟริกาใต้ ( 32 สัตว์ต่อสิ่งอำนวยความสะดวก ) สัตว์เหล่านี้สุ่มข้ามผองเพื่อนวางไข่ เพื่อให้ได้ตัวอย่างที่เป็นตัวแทนของประชากร F1 ทั้งหมดในแต่ละสถานที่ สัตว์มีอายุระหว่างสามและสี่ปีและได้ผ่านระบบการผลิตทั้งหมด รวมถึงหลายเกรดตามขั้นตอนของโรงงานแต่ละประเภทจึงทำให้ .กล้ามเนื้อและเนื้อเยื่อเหงือกจากการสัมภาษณ์แต่ละคนและวางไว้ในเอทานอล 70% และเก็บรักษาที่อุณหภูมิ 20 ° C −ไปจนถึงการสกัดดีเอ็นเออาจจะดำเนินการผ่านทางวิธีการ ctab มาตรฐาน ( saghai maroof et al . , 1984 ) สำหรับการเปรียบเทียบ , 96 สัตว์ป่าที่เคยรวบรวมจากทิศตะวันตก - ( อ่าว ซัลดาน่า , - ( witsand wpwc ) , ใต้ , ตะวันออกและ wpsc ) - ( riet จุด wpec ) ชายฝั่งของแอฟริกาใต้ ( 32 ตัว ) ยังใช้ ( มีอธิบายไว้ในเบสเตอร์ Van Der Merwe et al . , 2011 ) ประชากรเหล่านี้เป็นตัวแทนของบรรพบุรุษต้นตระกูลประชากรของแต่ละตนเลี้ยงประชากรตามเขตภูมิศาสตร์2.2 . การพัฒนาเครื่องหมายโมเลกุลเมื่อเร็ว ๆนี้ฟรานชินี et al . ( 2011 ) พัฒนาทรัพยากรสำหรับชั่วโมงอย่างมาก EST midae . การพัฒนาเครื่องหมายไมโครแซทเทลไลท์ contig EST , ลำดับจากทรัพยากรนี้ถูกนำเข้าสู่ batchprimer Ver - Sion 3 ซอฟต์แวร์ ( คุณ et al . , 2008 ) ; โปรแกรมนี้แล้ว พร้อมกันหาลำดับซ้ำและออกแบบไพรเมอร์เพื่อเพิ่มกำลัง - คีมจึงบวกของตนโดยการใช้พารามิเตอร์เริ่มต้น ทั้งหมดย้ำลาย dinucleotides เพื่อ hexanucleotides ถูกรวมอยู่ในการทำซ้ำ เป็น blastn ท้องถิ่นเพื่อใช้ในลำดับฐานข้อมูลที่มีทั้งหมด identi ก่อนหน้านี้จึงเอ็ดชนิดเซ - quences ) มีวัตถุประสงค์ เพื่อป้องกันความซ้ำซ้อน หลายวิธี optimi - ขั้นตอน sation ถูกใช้ตามอุณหภูมิอบและโปรโตคอล รวมทั้งมาตรฐานและทัชดาวน์โดยรอบด้วยโปรแกรม ( 1 ) promega ® gotaq PCR Kit , 2 ) kapa2g ™ PCR kit และ 3 ) ®แท็คทีมสปริงบอกซ์ Kit เกิดปฏิกิริยาได้ในปริมาณรวม 10 μ L ที่มี 20 นาโนดีเอ็นเอ 1 × บัฟเฟอร์ ชุด 2 มม. ,0.2 มม. dntps 0.5 วูทัค DNA polymerase ( Informa - เพิ่มเติมtion , ตาราง S1 ) เพื่อทดสอบจึง polyacrylamide gel ELEC - trophoresis ( 12% , 40 ×ข้ามเชื่อมโยงที่ 150 V 1 h30 ) คือการใช้แผงของแปดสุ่มบุคคล นี้ตามด้วยการตรวจสอบความเชื่อลำดับสองลำดับ โดยfl uorescently labelled สำหรับตำแหน่งที่เด็ม - onstrated ) กับหนึ่งในสีดังต่อไปนี้ ดูวิค สัตว์เลี้ยง เน็ด ( Applied Biosystems ) เพื่อช่วยส่งเสริมทางผู้ชม เพื่อการวิเคราะห์ต่อไปในกลุ่มประชากรศึกษา แปด tetranucleotide EST ไมโครแซเทลไลต์ที่ถูกเลือก2.3 การวิเคราะห์ทางพันธุกรรมของประชากรประชากรศึกษาการประเมินความหลากหลายทางพันธุกรรมในประชากรศึกษา แปด tetranucleotide ที่มีการพัฒนาผ่านทางไมโครแซเทลไลต์ก่อนหน้านี้ล้มเหลวโพรโทคอล ( เบสเตอร์ et al . , 2004 ; slabbert et al . , 2008 ) และแปดที่พัฒนาขึ้นใหม่ tetranucleotide EST ไมโครแซเทลไลต์แบบ ปฏิกิริยา PCR ทั้งหมดถูกดำเนินการในเล่ม 10 μผมจึงนาลและตามประเภทจึงทำให้ของผู้เขียน , การพัฒนาเครื่องหมายก่อนหน้านี้หรือปัจจุบัน อธิบายและเครื่องหมาย คะแนนในกลุ่มนี้ได้ใช้ genemapper ®รุ่น 4 ( Applied Biosystems ) tetranucleotide ซ้ำรอยอย่างเปลี่ยนแปลงเป็นมีเสถียรภาพมากขึ้นและโดยทั่วไปช่วยให้ง่ายและเชื่อถือได้มากขึ้นในการให้คะแนน . นอกจากนี้ เพื่อลดอคติ และเพื่อที่จะทำให้การเปรียบเทียบโดยตรงระหว่างจีโนมและ EST - ไมโครแซเทลไลต์ลวดลายซ้ำคล้ายถูกใช้ในชั้นเรียนเครื่องหมายโมเลกุล ไมโครตรวจสอบรุ่น 2.2.3 ( รถตู้ Oosterhout et al . , 2004 ) ถูกใช้เพื่อทดสอบหาข้อผิดพลาดการอ่านที่เป็นไปได้ และประธาน - อิทธิพล ( ของอัลลีล ( allele null null ประมาณการตามวิธีการของลำธารจึงละมั่ง , 1996 )สมดุลฮาร์ดีไวน์เบิร์ก ( ทดสอบความน่าจะเป็นที่แน่นอน 500 ชุด หมื่นรอบ ) , ที่คาดหวังและพบเฉพาะที่ตนจึง C และ speci fis ถูกคำนวณโดยใช้รุ่น genepop 4.0 ( รูเซ็ท , 2008 ) จำนวนอัลลีล allelic richness ถูกคำนวณและใช้รุ่น fstat 2.9.3.2 ( goudet , 1995 ) และ Kruskal - Wallis test ) เพื่อประเมิน signi จึงไม่สามารถเปรียบเทียบจำนวนของอัล - leles allele , ความมั่งคั่งและสังเกตโดยเฉพาะที่ในหมู่ประชากรและชั้นเรียน เครื่องหมายโมเลกุล นอกจากนี้ โอกาสของการเชื่อมโยงการเก็บน้ำระหว่างคู่ทั้งหมดสถานะคำนวณผ่านแน่นอนทดสอบการใช้ genepop . ความเป็นกลางคือการทดสอบโดยใช้การทดสอบที่แน่นอน slatkin ( 10000 กฎการสลับที่ ) ตาม ewens ทฤษฎีการสุ่มตัวอย่าง ( slatkin , 1994 ) ใน arlequin รุ่น 3.5.1.2( excof จึงเอ้อ และ lischer 2010 ) เป็น