PCR analysis of TCR/Ig rearrangemen

PCR analysis of TCR/Ig rearrangement
High-molecular weight DNA from marrow cells was initially
screened for major rearrangement patterns of TCRγ,
TCRδ, and Igκ, and secondarily screened for rearrangements
in Ig heavy chain (IgH), using previously described
primers [19-21]. Two-step (nested) PCR for MRD quantification
was performed using allele-specific oligonucleotide
(ASO)-primers based on the sequence of PCR
screening products, which had clonal recombinations by
heteroduplex analyses. Prior to PCR analysis, DNA samples
from post-treatment bone marrow samples and DNA
from the samples obtained at diagnosis were serially
diluted (between 10−2 and 10−5) with buffy coat DNA
from eight healthy volunteers. Buffy coat DNA was also
used as a control for nonspecific amplification of comparable
Ig/TCR arrangements present in normal cells. All
PCR reactions were performed simultaneously and analyzed
using ethidium staining and agarose gel electrophoresis.
MRD was quantified by comparing the intensities of
band signals on an agarose gel stained with ethidium
bromide without amplification of the background. MRD
quantifications were performed using ASO-primers with a
sensitivity of ≤1 × 10−4, and MRD positivity was defined as
a lower limit of detection of ≥1 × 10−3.

Results (Thai) 1:

วิเคราะห์ PCR rearrangement TCR/Igน้ำหนักสูงโมเลกุลดีเอ็นเอจากเซลล์ไขเป็นครั้งแรกฉายในรูปแบบหลัก rearrangement ของ TCRγTCRδ และ Igκ และสกรีนเชื่อมสำหรับ rearrangementsใน Ig หนักโซ่ (ข), ใช้อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ไพรเมอร์ [19-21] สองขั้นตอน (ซ้อนกัน) PCR นับ MRDทำใช้เฉพาะ allele oligonucleotide(เอโซ) -ไพรเมอร์ตามลำดับของ PCRการคัดกรองผลิตภัณฑ์ มี recombinations clonal โดยheteroduplex วิเคราะห์ ก่อนที่จะวิเคราะห์ PCR ตัวอย่างดีเอ็นเอจากตัวอย่างไขกระดูกหลังการรักษาและดีเอ็นเอจากตัวอย่างที่ได้รับการวินิจฉัยที่ถูก seriallyผสมกับตรามือใหม่ปราบผีดีเอ็นเอ (ระหว่าง 10−2 และ 10−5)จากอาสาสมัครสุขภาพ 8 มือใหม่ปราบผีเสื้อดีเอ็นเอยังเป็นใช้เป็นตัวควบคุมขยายที่เจาะจงของเทียบเท่าIg/TCR จัดแสดงในเซลล์ปกติ ทั้งหมดดำเนินการพร้อมกัน และวิเคราะห์ปฏิกิริยา PCRใช้ ethidium ย้อมสีและ agarose ครีม electrophoresisMRD ได้ quantified โดยการเปรียบเทียบการปลดปล่อยก๊าซของสัญญาณวงบนเจ agarose มีสี ด้วย ethidiumโบรไมด์ โดยขยายของพื้นหลัง MRDquantifications ได้ดำเนินการโดยใช้ไพรเมอร์เอโซกับการความไวของ ≤1 × 10−4, MRD positivity ถูกกำหนดเป็นขีดจำกัดล่างของการตรวจสอบของ ≥1 × 10−3

Results (Thai) 2:

การวิเคราะห์ PCR ของ TCR / Ig สายใย
ดีเอ็นเอน้ำหนักโมเลกุลสูงจากเซลล์ไขกระดูกแรกคือ
การตรวจคัดกรองรูปแบบการจัดเรียงตัวใหม่ที่สำคัญของTCRγ,
TCRδและIgκและการคัดเลือกครั้งที่สองสำหรับ rearrangements
ใน Ig โซ่หนัก (igh) ใช้อธิบายไว้ก่อนหน้า
ไพร [19 21] สองขั้นตอน (ซ้อน) PCR สำหรับปริมาณ MRD
ได้รับการดำเนินการโดยใช้ oligonucleotide เฉพาะอัลลีล
(ASO) -primers ขึ้นอยู่กับลำดับของ PCR
ผลิตภัณฑ์การตรวจคัดกรองซึ่งมี recombinations clonal โดย
การวิเคราะห์ heteroduplex ก่อนที่จะมีการวิเคราะห์ PCR ตัวอย่างดีเอ็นเอ
จากการโพสต์การรักษาตัวอย่างไขกระดูกและดีเอ็นเอ
จากตัวอย่างที่ได้รับการวินิจฉัยที่ถูกลำดับ
เจือจาง (ระหว่าง 10-2 และ 10-5) กับดีเอ็นเอบัฟฟีโค้
จากแปดอาสาสมัครสุขภาพดี มือใหม่ดีเอ็นเอเสื้อก็ถูก
นำมาใช้เป็นตัวควบคุมสำหรับการขยายเชิญชมการเทียบเคียง
การจัด Ig / TCR อยู่ในเซลล์ปกติ ทั้งหมด
ปฏิกิริยา PCR ได้ดำเนินการไปพร้อม ๆ กันและวิเคราะห์
โดยใช้การย้อมสี ethidium และเจลอิเล็ก agarose.
MRD ถูกวัดโดยการเปรียบเทียบความเข้มของ
สัญญาณวงเจล agarose ย้อมด้วย ethidium
bromide โดยไม่ต้องใช้เครื่องขยายเสียงของพื้นหลัง MRD
quantifications ถูกดำเนินการโดยใช้ไพรเมอร์ ASO-กับ
ความไวของ≤1× 10-4 และ MRD positivity ถูกกำหนดเป็น
วงเงินที่ต่ำกว่าของการตรวจสอบของ≥1× 10-3

Results (Thai) 3:

การวิเคราะห์ดีเอ็นเอของภูมิภาค / ig ใหม่
สูงโมเลกุลดีเอ็นเอจากเซลล์ไขกระดูกโดย
เพิ่มสาขาใหม่ในรูปแบบของγ
ประวัติ , ประวัติδและ IG κและครั้งที่สองจาก rearrangements
ใน IG โซ่หนัก ( ความ ) โดยใช้ไพรเมอร์อธิบาย
ก่อนหน้านี้ [ 2 ] สองขั้นตอน ( ซ้อนกัน ) ซึ่งปริมาณการใช้ MRD

ซึ่งในที่เฉพาะเจาะจง( อโศก ) - ไพรเมอร์ตามลําดับของ PCR
ผลิตภัณฑ์กลั่นกรองซึ่งมีรูปแบบ recombinations โดย
วิเคราะห์ heteroduplex . ก่อนการวิเคราะห์ตรวจตัวอย่างดีเอ็นเอจากตัวอย่างกระดูกหลัง

จากตัวอย่างดีเอ็นเอที่ได้รับการวินิจฉัยเป็นอนุกรม
เจือจาง ( ระหว่าง 10 − 2 และ 10 − 5 ) กับ Buffy ขนดีเอ็นเอ
จากแปดอาสาสมัครที่มีสุขภาพดี บัฟฟี่โคทดีเอ็นเอยัง
ใช้เป็นตัวควบคุมแบบไม่จำเพาะของเทียบเคียง
ig / ประวัติจัดอยู่ในเซลล์ปกติ ปฏิกิริยา PCR ได้พร้อมกันและวิเคราะห์ทั้งหมด

ใช้คู่ชนิดเจลอิเลคโตรโฟรีซีส .
MRD คือวัดได้โดยการเปรียบเทียบความเข้มของสัญญาณแถบบนเจล

โบรไมด์โดยไม่เปื้อนคู่แบบพื้นหลัง MRD
quantifications การใช้ไพรเมอร์ที่อโศกกับความไวของ≤
1 × 10 − 4 และ MRD positivity คือกำหนดขีดจำกัดล่างของการตรวจหาการ≥ 1 × 10 − 3