Among the AMPs identified in shrimp

Among the AMPs identified in shrimps, such as crustins, penaeidins, ALFs and stylicins, ALFPm3 exhibits the broadest reported range of antimicrobial activity ( Amparyup et al., 2008, Rolland et al., 2010, Somboonwiwat et al., 2005 and Supungul et al., 2008). Compared to crustinPm7 (a cationic peptide) and Ls-stylicins 1 (an anionic peptide), ALFPm3 exhibits a stronger antibacterial activity against V. harveyi, which is an important shrimp bacterial pathogen ( Amparyup et al., 2008, Rolland et al., 2010 and Somboonwiwat et al., 2005). The MIC value of rALFPm3 on V. harveyi 639 determined in this study (0.78–1.56 μM) was the same as reported previously for V. harveyi 1526 at 0.78–1.56 μM (Somboonwiwat et al., 2005).

The 3D structure of ALFPm3 contains three α-helices packed against four strands of β-sheet. By comparative molecular modeling, the hypothetical LPS-binding domain is located on the S2–S3 β-hairpin that is stabilized by a disulfide bond. This binding site consists of six positively charged amino acid residues (four Lys and two Arg) that might bind to the hydrophilic and phosphate groups of lipid A on the bacterial membrane ( Yang et al., 2009). ALFPm3 has been shown to be able to bind to the principal bacterial cell wall components of Gram-negative (LPS) and Gram-positive (LTA) bacteria, as well as to whole (intact) E. coli 363 and Bacillus elaterium cells ( Somboonwiwat et al., 2008). We showed here that rALFPm3 could also bind to V. harveyi cells, which may suggest a common mechanism of rALFPm3 binding on various bacteria. In this scenario, the peptide initially binds to the cell wall of bacteria through the ionic interactions between the cationic peptide and the negatively charged of bacterial cell wall components.

Typically, most cationic AMPs have been reported to operate through membrane permeabilization/disruption, but interactions with intracellular targets or disruption of cellular processes have also been reported (Brogden, 2005 and Nicolas, 2009). Although the ALF from the Indian mud crab Scylla serrata was reported to be able to permeabilize artificial membranes in vitro ( Yedery and Reddy, 2009), there has been no previous report on the in vivo study. Here in rALFPm3 was found to permeabilize the outer and inner membrane of V. harveyi in a dose- and time-dependent manner. In accord, the shrimp AMP, crustinPm7, has been reported recently to be able to permeabilize the inner membrane of E. coli MG1655 but with a lower activity compared to that reported here for rALFPm3 ( Krusong et al., 2012). The rALFPm3-treated V. harveyi cells showed a significant increase in the nucleotide leakage, indicating that after rALFPm3 binding to the membrane lipid it causes membrane permeabilization to varying extents and this was in a time- and concentration-dependent manner, as inferred from the deduced levels of the induced nucleotide leakage. Thus, rALFPm3 likely penetrates across the bacterial membrane and forms a transmembrane pore leading to the leakage of the bacterial cytoplasmic contents. According to the results, it should be noted that pore size on V. harveyi cells treated with rALFPm3 should be big enough for macromolecule like β-galactosidase and nucleotide to pass through.

Previously, several studies showed that the cellular damages of bacterial cells treated with AMP were continued to accumulate behind the time required for antimicrobial killing. For example, Pseudomonas aeruginosa exposed to SMAP19 and CAP18 was killed in 15 min; however, the ultrastructural damage continued for up to 8 h (Kalfa et al., 2001). SEM and TEM evaluation of the changes in the ultrastructure of the V. harveyi cells after rALFPm3 incubation for up to 1 h revealed several distinct signs of cell damage in support of the above postulated pore formation by rALFPm3, such as cytoplasmic content leakage, bleb formation and potential pore formation. The blebs protruded on the surface of V. harveyi cells after rALFPm3-treating, might be caused by the positive charge on the LPS-binding site of rALFPm3 substituting for the cations, such as K+, Ca2+ and Mg2+, on the outer membrane of the bacteria and so leading to the outer membrane of bacteria being destabilized. After that, the inner membrane was permeabilized and the cytoplasmic content leaked to the periplasmic space resulting in the protruding of the outer membrane from the bacterial surface (da Silva and Teschke, 2003).

Overall, we conclude that rALFPm3 can bind to V. harveyi cells leading to the permeabilization of the bacterial membranes, and that this is likely to be pore formation. The cytoplasmic contents of the bacterial cell can then leak from the inside to the outside of the cells leading to cell death. The understanding of mechanism of action of rALFPm3 is essential for its development as a therapeutic agent

Results (Thai) 1:

ในบรรดาแอมป์ที่พบในกุ้ง เช่น crustins, penaeidins, ALFs และ stylicins, ALFPm3 แสดงรายงานช่วงกว้างของต้านจุลชีพ (Amparyup et al. 2008, Rolland et al. 2010, Somboonwiwat et al. 2005 และ Supungul et al. 2008) เมื่อเทียบกับ crustinPm7 (เปปไทด์ cationic) และความแข็งแกร่งต้านแบคทีเรียกับ V. harveyi ซึ่งเป็นเชื้อแบคทีเรียสำคัญกุ้งแสดง Ls-stylicins 1 (เป็น anionic เปปไทด์), ALFPm3 (Amparyup et al. 2008, Rolland et al. 2010 และ Somboonwiwat et al. 2005) ค่า MIC ของ rALFPm3 ใน V. harveyi 639 กำหนดในการศึกษานี้ (0.78-1.56 ไมครอน) เดียวกับรายงานก่อนหน้านี้สำหรับ V. harveyi ที่ 1526 ที่ 0.78-1.56 μ m (Somboonwiwat et al. 2005)โครงสร้าง 3D ของ ALFPm3 ประกอบด้วยสามα-helices บรรจุกับβ-แผ่นสี่เส้น โดยการเปรียบเทียบแบบจำลองโมเลกุล LPS รวมโดเมนสมมุติตั้งอยู่บน S2-S3 βกิ๊บที่เสถียร ด้วยพันธะไดซัลไฟด์ เว็บไซต์รวมนี้ประกอบด้วย 6 กรดอะมิโนที่มีประจุบวกตก (Lys สี่และอาร์กิวเมนต์ของค่าที่สอง) ที่อาจผูกกับกลุ่มน้ำและฟอสเฟตของไขมัน A บนเมมเบรนแบคทีเรีย (Yang et al. 2009) ALFPm3 ได้รับการแสดงเพื่อให้สามารถผูกกับส่วนประกอบของผนังเซลล์แบคทีเรียหลักของแบคทีเรียแบคทีเรียแกรมบวก (LTA) และแกรมลบ (LPS) เป็นทั้งหมดเพื่อ E. coli (เหมือนเดิม) 363 และแบคทีเรีย elaterium เซลล์ (Somboonwiwat et al. 2008) เราพบว่าที่นี่ rALFPm3 ที่ยังไม่สามารถผูกกับ V. harveyi เซลล์ ซึ่งอาจแนะนำกลไกทั่วไปของ rALFPm3 ผูกบนแบคทีเรียต่าง ๆ ในสถานการณ์สมมตินี้ เปปไทด์เริ่มผูกติดกับผนังเซลล์ของเชื้อแบคทีเรียที่ผ่านการโต้ตอบระหว่างเปปไทด์ cationic การประจุไอออนส่วนผนังเซลล์แบคทีเรียโดยทั่วไป แอมป์ cationic สุดได้รับรายงานการใช้งานผ่านเมมเบรน permeabilization/ทรัพย แต่โต้ตอบกับการสกัด intracellular เป้าหมายหรือหยุดชะงักของกระบวนการที่เซลลูลาร์ยังได้รับรายงาน (Brogden, 2005 และ Nicolas, 2009) แม้ว่า ALF จากอินเดียโคลนปูปูรายงานสามารถ permeabilize ประดิษฐ์เยื่อหุ้มในหลอดทดลอง (Yedery และ Reddy, 2009), มีการรายงานก่อนหน้านี้ไม่มีการศึกษาในสัตว์ทดลอง ที่นี่ใน rALFPm3 พบกับ permeabilize ภายนอก และภายในเมมเบรนของ V. harveyi ในลักษณะปริมาณ และเวลาขึ้น ในแอคคอร์ด AMP, crustinPm7 กุ้งได้รายงานเมื่อเร็ว ๆ นี้สามารถ permeabilize ภายในเมมเบรน ของไล MG1655 แต่ มีกิจกรรมที่ต่ำเมื่อเทียบกับที่รายงานนี่สำหรับ rALFPm3 (Krusong et al. 2012) RALFPm3-ถือ V. harveyi เซลล์แสดงเพิ่มในรั่วนิวคลีโอไทด์ ระบุว่า หลังจาก rALFPm3 ผูกไขมันเยื่อเมมเบรน permeabilization การขอบเขตโดยรวมแตกต่างกันทำให้ และนี้ในลักษณะขึ้นกับเวลา และความเข้มข้น เป็นข้อสรุปจากระดับการรั่วไหลการเกิดนิวคลีโอไทด์ซึ่งสามารถกล่าวได้ ดังนั้น rALFPm3 จะซึมผ่านเยื่อหุ้มเซลล์แบคทีเรีย และแบบรูพรุน transmembrane ที่นำไปสู่การรั่วไหลของเนื้อหารายการเลือกแบคทีเรีย ตามผล ควรสังเกตว่า ขนาดของรูพรุนบน V. harveyi เซลล์รักษา ด้วย rALFPm3 ควรจะใหญ่พอสมควรเช่นβ-galactosidase และนิวคลีโอไทด์ผ่านก่อนหน้านี้ หลายการศึกษาพบว่าเสียหายโทรศัพท์ของเซลล์แบคทีเรียด้วย AMP ได้อย่างต่อเนื่องสะสมหลังใช้เวลาฆ่าต้านจุลชีพ เช่น Pseudomonas aeruginosa สัมผัสกับ SMAP19 และ CAP18 ถูกฆ่าตายใน 15 นาที อย่างไรก็ตาม ความเสียหายที่ศึกษาลักษณะชนิดอย่างต่อเนื่องถึง 8 ชม (Kalfa et al. 2001) SEM และ TEM ประเมินเปลี่ยน ultrastructure V. harveyi เซลล์หลังจากบ่ม rALFPm3 สำหรับถึง 1 ชม.เผยหลายแตกต่างสัญญาณของความเสียหายของเซลล์สนับสนุนข้างต้น postulated ก่อรูขุมขน โดย rALFPm3 เช่นรายการเลือกเนื้อหารั่ว bleb ก่อตัว และก่อเกิดรูขุมขน Blebs protruded บนผิว V. harveyi เซลล์หลังจากรักษา rALFPm3 อาจเกิดได้ โดยการบวก LPS-รวมเว็บไซต์ของ rALFPm3 แทนสำหรับการแคทไอออน เช่น K + Ca2 + และ Mg2 + บนเมมเบรนชั้นนอกของแบคทีเรีย และเพื่อ นำไปสู่เยื่อด้านนอกของแบคทีเรียการ destabilized หลังจากนั้น เมมเบรนชั้นในถูก permeabilized และรายการเลือกเนื้อหาที่รั่วไป periplasmic ในยื่นออกมาของเมมเบรนชั้นนอกผิวแบคทีเรีย (da Silva และ Teschke, 2003)โดยรวม เราสรุป rALFPm3 ที่สามารถผูกกับ V. harveyi ที่เซลล์นำไป permeabilization ของเยื่อหุ้มแบคทีเรีย และที่นี่จะเป็นรูขุมขนก่อตัว แล้วรายการเลือกเนื้อหาของเซลล์แบคทีเรียสามารถรั่วไหลจากด้านในด้านนอกของเซลล์นำไปสู่การตายของเซลล์ ความเข้าใจกลไกของการกระทำของ rALFPm3 เป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการพัฒนาเป็นตัวแทนรักษา

Results (Thai) 2:

ในบรรดาแอมป์ที่ระบุไว้ในกุ้งเช่น crustins, penaeidins, Alfs และ stylicins, ALFPm3 การจัดแสดงนิทรรศการในช่วงที่รายงานที่กว้างที่สุดของฤทธิ์ต้านจุลชีพ (Amparyup et al., 2008 Rolland et al., 2010 Somboonwiwat et al., ปี 2005 และ Supungul et al., 2008) เมื่อเทียบกับ crustinPm7 (เปปไทด์ที่มีประจุบวก) และ LS-stylicins 1 (เป็นเปปไทด์ประจุลบ) ALFPm3 การจัดแสดงนิทรรศการฤทธิ์ต้านแบคทีเรียที่แข็งแกร่งกับ V. harveyi ซึ่งเป็นกุ้งที่สำคัญการติดเชื้อแบคทีเรีย (Amparyup et al., 2008 Rolland et al., ปี 2010 และ Somboonwiwat et al., 2005) ค่า MIC ของ rALFPm3 บน V. harveyi 639 ที่กำหนดไว้ในการศึกษาครั้งนี้ (0.78-1.56 ไมครอน) ได้เหมือนกันตามที่รายงานก่อนหน้านี้สำหรับ V. harveyi 1526 ที่ 0.78-1.56 ไมครอน (Somboonwiwat et al., 2005). โครงสร้าง 3 มิติของ ALFPm3 มีสามαเอนริเก้บรรจุกับสี่เส้นของβแผ่น โดยการสร้างแบบจำลองโมเลกุลเปรียบเทียบโดเมน LPS ผูกพันสมมุติตั้งอยู่บน S2-S3 β-กิ๊บที่มีเสถียรภาพโดยพันธบัตรซัลไฟด์ เว็บไซต์นี้มีผลผูกพันประกอบด้วยหกประจุบวกกรดอะมิโน (สี่ลิซและสอง Arg) ที่อาจเชื่อมโยงกับกลุ่มที่ชอบน้ำและฟอสเฟตของไขมันในเยื่อหุ้มเซลล์แบคทีเรีย (Yang et al., 2009) ALFPm3 ได้รับการแสดงที่จะสามารถเชื่อมโยงกับหลักแบคทีเรียส่วนประกอบของผนังเซลล์ของแบคทีเรียแกรมลบ (LPS) และแบคทีเรียแกรมบวก (LTA) เช่นเดียวกับทั้ง (เหมือนเดิม) 363 E. coli และ Bacillus เซลล์ elaterium (Somboonwiwat et al., 2008) เราแสดงให้เห็นว่าที่นี่ rALFPm3 ยังสามารถเชื่อมโยงกับเซลล์เชื้อ V. harveyi ซึ่งอาจแนะนำกลไกร่วมกันของ rALFPm3 ผลผูกพันกับแบคทีเรียต่างๆ ในสถานการณ์สมมตินี้เปปไทด์แรกผูกกับผนังเซลล์ของแบคทีเรียที่ผ่านการมีปฏิสัมพันธ์ไอออนิกระหว่างเปปไทด์ที่มีประจุบวกและประจุลบของส่วนประกอบของผนังเซลล์ของแบคทีเรีย. โดยปกติแอมป์ประจุบวกส่วนใหญ่ได้รับรายงานจะดำเนินการผ่านเมมเบรน permeabilization / หยุดชะงัก แต่การมีปฏิสัมพันธ์ กับกลุ่มเป้าหมายภายในเซลล์หรือการหยุดชะงักของกระบวนการโทรศัพท์มือถือนอกจากนี้ยังได้รับรายงาน (Brogden 2005 และนิโคลัส 2009) แม้ว่าอาล์ฟจากอินเดียปูทะเล Scylla serrata ถูกรายงานเพื่อให้สามารถ permeabilize เยื่อเทียมในหลอดทดลอง (Yedery และเรดดี้ 2009) ยังไม่มีการรายงานก่อนหน้านี้เกี่ยวกับการศึกษาในร่างกาย ที่นี่ใน rALFPm3 พบว่า permeabilize เยื่อหุ้มด้านนอกและด้านในของ V. harveyi ในลักษณะ dose- และเวลาขึ้นอยู่กับ ตามที่แอมป์กุ้ง crustinPm7 ได้รับรายงานเมื่อเร็ว ๆ นี้เพื่อให้สามารถ permeabilize เยื่อชั้นในของเชื้อ E. coli MG1655 แต่มีกิจกรรมลดลงเมื่อเทียบกับรายงานที่นี่สำหรับ rALFPm3 (Krusong et al., 2012) วี rALFPm3 รับการรักษาเซลล์ harveyi พบว่าเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในการรั่วไหลเบื่อหน่ายที่ระบุว่าหลังจาก rALFPm3 ผูกพันกับไขมันเมมเบรนจะทำให้เกิดพังผืดที่ permeabilization ขอบเขตที่แตกต่างกันและนี่ก็เป็นในลักษณะที่เวลาและความเข้มข้นขึ้นอยู่กับว่าเป็นสรุปจาก ระดับอนุมานของการรั่วไหลของเบสที่เหนี่ยวนำให้เกิด ดังนั้น rALFPm3 แนวโน้มที่แทรกซึมผ่านเยื่อหุ้มเซลล์แบคทีเรียและรูปแบบของรูพรุนรนนำไปสู่การรั่วไหลของเนื้อหานิวเคลียสแบคทีเรีย ตามผลการก็ควรจะตั้งข้อสังเกตว่าขนาดรูขุมขนบนเซลล์เชื้อ V. harveyi รับการรักษาด้วย rALFPm3 ควรจะใหญ่พอสำหรับโมเลกุลเช่นβ-galactosidase และเบื่อหน่ายที่จะผ่าน. ก่อนหน้านี้หลายการศึกษาพบว่าความเสียหายที่โทรศัพท์มือถือของเซลล์แบคทีเรียรับการรักษาด้วย แอมป์ได้รับการอย่างต่อเนื่องที่จะสะสมอยู่เบื้องหลังเวลาที่จำเป็นสำหรับการฆ่ายาต้านจุลชีพ ยกตัวอย่างเช่น Pseudomonas aeruginosa สัมผัสกับ SMAP19 และ CAP18 ถูกฆ่าตายใน 15 นาที; แต่ความเสียหาย ultrastructural อย่างต่อเนื่องได้นานถึง 8 ชั่วโมง (Kalfa et al., 2001) SEM และการประเมินผล TEM ของการเปลี่ยนแปลงใน ultrastructure ของเซลล์เชื้อ V. harveyi หลังจาก rALFPm3 บ่มนานถึง 1 ชั่วโมงที่เผยให้เห็นสัญญาณที่แตกต่างกันหลายของความเสียหายของเซลล์ในการสนับสนุนของการก่อตัวของรูพรุนสมมติฐานข้างต้นโดย rALFPm3 เช่นการรั่วไหลของเนื้อหานิวเคลียสก่อ bleb และการก่อตัวของรูขุมขนที่มีศักยภาพ หุ้มที่ยื่นออกมาบนพื้นผิวของเซลล์ V. harveyi หลังจาก rALFPm3 การรักษาอาจจะเกิดจากประจุบวกบนเว็บไซต์ LPS-ผูกพันของ rALFPm3 แทนไพเพอร์เช่น K + Ca2 + และ Mg2 + ในเยื่อหุ้มชั้นนอกของ แบคทีเรียและเพื่อนำไปสู่เยื่อหุ้มชั้นนอกของเชื้อแบคทีเรียที่ถูกคาดไม่ถึง หลังจากนั้นเยื่อหุ้มชั้นถูก permeabilized และเนื้อหานิวเคลียสรั่วไหลไปยังพื้นที่ periplasmic ผลในการยื่นออกมาของเยื่อหุ้มชั้นนอกจากพื้นผิวของแบคทีเรีย (ดาซิลวาและ Teschke, 2003) ได้. โดยรวมแล้วเราสรุปได้ว่า rALFPm3 สามารถผูกกับ V. harveyi เซลล์ที่นำไปสู่ ​​permeabilization ของเยื่อแบคทีเรียและที่นี้มีแนวโน้มที่จะก่อตัวของรูขุมขน เนื้อหานิวเคลียสของเซลล์แบคทีเรียก็จะสามารถรั่วออกมาจากภายในสู่ภายนอกของเซลล์ที่นำไปสู่การตายของเซลล์ ความเข้าใจเกี่ยวกับกลไกการออกฤทธิ์ของ rALFPm3 เป็นสิ่งจำเป็นสำหรับการพัฒนาของการเป็นตัวแทนในการรักษา