PCR amplification and sequence anal

PCR amplification and sequence analysis of the internally transcribed spacer region

The 5.8S-internally transcribed spacer (ITS) rDNA regions (ITS1 and ITS2) of laboratory strains and natural isolates (Table 1) were PCR amplified from the genomic DNA using the ITS5 (5′-GGAGAAAAGTCGTAACAAGG-3′) and ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′) primers. PCR amplifications were performed in a 50 μl reaction volume supplemented with 50 ng of genomic DNA, 10 pmol of each primer, 10 μM of each dNTP and 1 unit of Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Thermo Scientific, USA). All the amplifications were programmed in a T100 thermo cycler (BIO RAD, India) as follows: 98°C for 3 min, followed by 35 cycles of 98°C for 30 s, 50°C for 30 s and 72°C for 1 min, with a final extension step at 72°C for 10 min. The amplified PCR products were separated on a 0.8% (w/v) agarose gel in 1X TAE (40 mM Tris-Acetate, 1 mM EDTA pH 8.0) buffer and detected by staining with ethidium bromide.

The amplified PCR products of the 5.8S-ITS rDNA regions were purified using the QIAquick_PCR Purification Kit (Qiagen, Germany) and sequenced using the ITS5 and ITS4 primers. A BLAST search of the sequences was performed using the Gene Bank data library, National Centre for Biotechnology Information (NCBI). Cluster analysis was conducted using a neighbor-joining method from the software package MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 5).

Results (Thai) 1:

วิเคราะห์ขยายและลำดับของ PCR ของ spacer ทับภายในภูมิภาค5.8S-ทับภายใน spacer (ของ) ภูมิภาคที่ rDNA (ITS1 และ ITS2) ของห้องปฏิบัติการสายพันธุ์และธรรมชาติแยก (ตารางที่ 1) ได้ขยายจากดีเอ็นเอออกใช้ ITS5 การ PCR (5 ′-GGAGAAAAGTCGTAACAAGG-3′) และไพรเมอร์ (5 ′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′) ITS4 ดำเนินการในเสริม ด้วย 50 โวลุ่ม 50 μl ปฏิกิริยา PCR amplifications ฉบับออกดีเอ็นเอ 10 pmol แต่ละพื้น 10 μ m ของแต่ละ dNTP และ 1 หน่วยของ Phusion เที่ยงดีเอ็นเอพอลิเมอเรส (เทอร์โมวิทยาศาสตร์ สหรัฐอเมริกา) Amplifications ทั้งหมดมีโปรแกรม cycler เทอร์โม T100 (BIO RAD อินเดีย) เป็นดังนี้: 98° C เป็นเวลา 3 นาที ตาม ด้วยรอบ 35 ของ 98° C 30 s, 50° C 30 s และ 72° C เป็นเวลา 1 นาที มีส่วนขยายเป็นขั้นสุดท้ายขั้นที่ 72° C เป็นเวลา 10 นาที ขยายผลิตภัณฑ์ PCR ถูกคั่นบนเจล agarose 0.8% (w/v) ในบัฟเฟอร์ 1 X TAE (40 มม.ทริสเรทติ้ง Acetate, 1 mM EDTA pH 8.0) และตรวจพบเปรอะเปื้อนด้วยโบรไมด์ ethidiumผลิตภัณฑ์ PCR ขยายของการ 5.8S-ภูมิภาคของ rDNA ถูกบริสุทธิ์ใช้ชุดฟอก QIAquick_PCR (Qiagen เยอรมัน) และเรียงลำดับโดยใช้ไพรเมอร์ที่ ITS5 และ ITS4 การค้นหาระเบิดลำดับดำเนินการใช้ไลบรารีข้อมูล ธนาคารยีน ศูนย์แห่งชาติสำหรับข้อมูลเทคโนโลยีชีวภาพ (NCBI) การวิเคราะห์คลัสเตอร์ดำเนินการโดยใช้วิธีการเข้าร่วมกับเพื่อนบ้านจากแพคเกจซอฟต์แวร์ล้าน (โมเลกุลวิวัฒนาการพันธุศาสตร์วิเคราะห์รุ่น 5)

Results (Thai) 2:

ขยาย PCR และการวิเคราะห์ลำดับของภูมิภาค spacer คัดลอกภายใน

5.8S-ภายในคัดลอก spacer (ITS) rDNA ภูมิภาค (ITS1 และ ITS2) สายพันธุ์ในห้องปฏิบัติการและสายพันธุ์ตามธรรมชาติ (ตารางที่ 1) ได้รับการขยาย PCR จากดีเอ็นเอโดยใช้ ITS5 (5 '-GGAGAAAAGTCGTAACAAGG-3) และ ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') ไพรเมอร์ เครื่องขยายเสียง PCR ได้ดำเนินการในปริมาณ 50 ไมโครลิตรปฏิกิริยาเสริมด้วย 50 NG ของดีเอ็นเอ 10 pmol ของแต่ละไพรเมอร์ 10 ไมครอนของแต่ละ dNTP และ 1 หน่วย Phusion ความจงรักภักดีสูง DNA Polymerase (Thermo Scientific, สหรัฐอเมริกา) เครื่องขยายเสียงทั้งหมดถูกตั้งโปรแกรมใน T100 Thermo Cycler (BIO RAD อินเดีย) เป็นดังนี้: 98 ° C เป็นเวลา 3 นาทีตามด้วย 35 รอบจาก 98 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาที, 50 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาทีและ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 นาทีด้วยขั้นตอนสุดท้ายส่วนขยายที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาที ผลิตภัณฑ์ PCR ขยายถูกแยกบน 0.8% (w / v) เจล agarose ใน 1X TAE (40 มิลลิเมตร Tris-Acetate 1 มิ EDTA ค่า pH 8.0) buffer และตรวจพบโดยการย้อมสีด้วย ethidium bromide.

ผลิตภัณฑ์ PCR ขยายของ 5.8S ภูมิภาค -ITS rDNA บริสุทธิ์โดยใช้ QIAquick_PCR บริสุทธิ์ Kit (Qiagen, เยอรมนี) ติดใจใช้ ITS5 และ ITS4 ไพรเมอร์ ค้นหาระเบิดของลำดับที่ถูกดำเนินการโดยใช้ยีนธนาคารห้องสมุดข้อมูลแห่งชาติศูนย์ข้อมูลเทคโนโลยีชีวภาพ (NCBI) การวิเคราะห์กลุ่มได้ดำเนินการโดยใช้วิธีการเพื่อนบ้านเข้าจาก MEGA แพคเกจซอฟต์แวร์ (อณูพันธุศาสตร์วิวัฒนาการวิเคราะห์รุ่น 5)

Results (Thai) 3:

การขยาย PCR และการวิเคราะห์ลำดับของ spacer ภายในและภูมิภาคการ 5.8s-internally rDNA spacer ( ITS ) และภูมิภาค ( its1 และ its2 ) ของสายพันธุ์ที่ห้องปฏิบัติการและธรรมชาติสายพันธุ์ ( ตารางที่ 1 ) ซึ่งขยายจาก genomic DNA โดยใช้ its5 ( 5 ’ - ggagaaaagtcgtaacaagg-3 School ) และ its4 ( 5 ’ - ’ tcctccgcttattgatatgc-3 ) รองพื้น โดยมีการปฏิบัติใน amplifications 50 μ L ปฏิกิริยาปริมาณเติม 50 นาโนดีเอ็นเอ , 10 pmol ของแต่ละคู่ , 10 μ M ของแต่ละ dntp 1 หน่วย phusion ความจงรักภักดีดีเอ็นเอพอลิเมอเรสสูง ( Thermo วิทยาศาสตร์ , USA ) amplifications ทั้งหมดเป็นโปรแกรมใน T100 thermo cycler ( ไบโอ ราด อินเดีย ) ดังนี้ : 98 ° C เป็นเวลา 3 นาที ตามด้วย 35 รอบ 98 ° C 30 , 50 ° C เป็นเวลา 30 วินาทีและ 72 ° C เป็นเวลา 1 นาทีด้วยขั้นตอนการสุดท้ายที่ 72 ° C เป็นเวลา 10 นาที การขยาย PCR ผลิตภัณฑ์แยกเป็น 0.8 % ( w / v ) 1x เจลในแท ( 40 มม. นอกจากนี้ อะซิเตท , 1 mM EDTA pH 8.0 ) บัฟเฟอร์ และตรวจโดยการย้อมสีด้วยทิเดียมโบรไมด์ .การขยาย PCR ผลิตภัณฑ์ของ 5.8s-its rDNA เขตบริสุทธิ์ใช้ qiaquick_pcr ฟอก Kit ( QIAGEN , เยอรมนี ) และลำดับการใช้ its5 its4 และรองพื้น ระเบิดการค้นหาของลำดับการใช้ธนาคารยีนข้อมูลห้องสมุด , ศูนย์สารสนเทศเทคโนโลยีชีวภาพแห่งชาติ ( ncbi ) การวิเคราะห์กลุ่มจำนวนเพื่อนบ้านเข้าร่วม วิธีจากเมกา ( แพคเกจซอฟต์แวร์การวิเคราะห์พันธุศาสตร์วิวัฒนาการโมเลกุลรุ่น 5 )