Diagnosis and monitoring of complex

Diagnosis and monitoring of complex diseases such as cancer require quantitative detection of multiple proteins. Recent work has shown that when specific biomolecular binding occurs on one surface of a microcantilever beam, intermolecular nanomechanics bend the cantilever, which can be optically detected. Although this label-free technique readily lends itself to formation of microcantilever arrays, what has remained unclear is the technologically critical issue of whether it is sufficiently specific and sensitive to detect disease-related proteins at clinically relevant conditions and concentrations. As an example, we report here that microcantilevers of different geometries have been used to detect two forms of prostate-specific antigen (PSA) over a wide range of concentrations from 0.2 ng/ml to 60 mug/ml in a background of human serum albumin (HSA) and human plasminogen (HP) at 1 mg/ml, making this a clinically relevant diagnostic technique for prostate cancer. Because cantilever motion originates from the free-energy change induced by specific biomolecular binding, this technique may offer a common platform for high-throughput label-free analysis of protein–protein binding, DNA hybridization, and DNA–protein interactions, as well as drug discovery.

Introduction
It is becoming increasingly evident that high-throughput identification and quantitation of a large number of biological molecules is important for generating a molecular profile that is critical in diagnosis, monitoring, and prognostic evaluation of complex diseases such as cancer1, 2. For genetic analysis, commercially available nucleic acid microarrays allow sensitive identification of thousands of DNA sequences simultaneously. For protein analysis, which is directly relevant for disease detection, high-throughput diagnostics has, however, remained a challenge. Multiplexed protein analysis techniques currently used can be broadly divided into four different categories: (1) radioactive, chemiluminescent, or fluorescent reporting of antigen–antibody binding3, 4, 5; (2) time-of-flight mass spectroscopy6; (3) electrophoretic separation7; and (4) detection of changes in surface properties due to antigen–antibody binding8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15. Although they all have their individual strengths, they currently suffer either from the inability to identify or quantitate proteins7, or nonspecific binding of a serum analyte to the sensor surface16. Truly universal label-free biosensors for sensitive and specific detection of protein analytes in a high-throughput fashion are not yet a reality.

Recent papers have reported the observation that when specific biomolecular interactions occur on one surface of a microcantilever beam, the cantilever bends17, 18, 19, 20 (see Fig. 1). The recent discovery of the origin of nanomechanical motion generated by DNA hybridization and protein–ligand binding19 provided some insight into the specificity of the technique. In addition, its use for DNA–DNA hybridization detection, including accurate positive/negative detection of one–base pair mismatches, was also reported19, 20. Besides being label free, this technology readily lends itself to formation of microarrays using well-known microfabrication techniques21, thereby offering the promising prospect of high-throughput protein analysis. What has remained unclear, however, is whether this technique has sufficient specificity and sensitivity to be used for the detection of disease-related proteins at clinically relevant conditions and concentrations. To address this technologically critical issue, we demonstrate in this paper the application of this technique for sensitive and specific detection of PSA as an example of both protein–protein binding in general and tumor marker detection in particular.

Figure 1: Diagram of interactions between target and probe molecules on cantilever beam.

Figure 1 : Diagram of interactions between target and probe molecules on cantilever beam.
Specific biomolecular interactions between target and probe molecules alter the intermolecular nanomechanical interactions within a self-assembled monolayer on one side of a cantilever beam. This can produce a sufficiently large force to bend the cantilever beam and generate motion.

Full size image (7 KB)

Prostate cancer is currently the most prevalent form of cancer in men and the second leading cause of male cancer death in the United States. PSA that is detectable in serum has proved to be an extremely useful marker for early detection of prostate cancer and in monitoring patients for disease progression and the effects of treatment. PSA is a 33–34 kDa glycoprotein with chymotrypsin-like protease activity. This enzymatically active form of PSA forms complexes with the serum protease inhibitor alpha1-antichymotrypsin (ACT) to create the predominant form of PSA in serum. PSA also forms a complex with alpha2-macroglobulin (A2M) and other serum enzyme inhibitors, but to a much lesser degree22, 23. The PSA test is limited by its relative lack of accuracy in men whose PSA levels fall in the "diagnostic gray zone" of 4–10 ng/ml. The distinction between complexed PSA (cPSA) and unbound or free PSA (fPSA), however, has become recognized as a clinically relevant feature of the PSA tests. Thus, although approximately 75–85% of PSA exists as cPSA in benign prostatic hypertrophy (BPH), the proportion increases to lie between 90 and 100% in prostate cancer; thus the lower the fPSA in serum, the higher are the chances of malignancy. Most newer diagnostic assays take this into account by incorporating dual labels for simultaneous and equimolar measurement of fPSA and cPSA. Although there are controversies regarding the frequency of screening, proponents of PSA-based prostate cancer screening maintain that early detection is the closest thing currently to a cure24. Most of the current PSA assays are variations of enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA), differing in detection by virtue of either enzymatic, fluorescent, or chemiluminescent labels, which report on the specific formation of PSA immune complex. Generally, two distinct monoclonal antibodies directed against different PSA epitopes are used in a "sandwich assay" format for capture and detection, which enhances the specificity.

In this paper, we have used a polyclonal anti-PSA antibody as a "ligand" covalently linked to the cantilever surface. The cantilever deflection due to specific fPSA binding with this antibody allows us to detect fPSA concentrations from 0.2 ng/ml to 60 mug/ml, which includes the clinically relevant diagnostic PSA concentration range. We have been able to detect fPSA even against the simulated background "noise" of unrelated human serum proteins such as HP and HSA or nonhuman serum protein such as bovine serum albumin (BSA), which were present at concentrations as high as 1 mg/ml. This indicates that we have been able to largely alleviate the problem of nonspecific binding and assay interference due to the nontarget analytes. We have also been able to attain similar specificity and range of sensitivity with cPSA.

top of page
Results and discussion

Figure 2A shows the cantilever deflection as a function of time for different concentrations of fPSA in a mixture with 1 mg/ml of BSA as background. The cantilevers used (see Fig. 6) in this set of experiments (Figs 2, 3) were made of silicon nitride (SiNx) with a thin coating of gold on one side and with a length of 200 mum, thickness of 0.5 mum, and each leg 20 mum wide. The gold film was used to immobilize the PSA antibody to the cantilever through thiol chemistry (see Experimental Protocol). With PSA antibody immobilized on the bottom gold surface of the cantilever, the cantilever was found always to bend up as a result of antigen–antibody binding. This is caused by the increased intermolecular repulsion between the antigen–antibody complexes on the cantilever surface. It is evident that over a time period of 3–4 h, the cantilever deflection increased and then saturated to a steady-state value. The long detection time is caused either by diffusion of molecules in the fluid cell or through conformational relaxation of the antigen–antibody complex on the cantilever surface25. The diffusion time scale, tau = L2/2D, for a fluid cell size of L approximately 0.1 cm and PSA diffusion coefficient D approximately 8.5 times 10-7 cm2/s (see Experimental Protocol), is on the order of 100 min, which is the time scale observed, making diffusion the likely candidate for the long detection time. The diffusion can be significantly enhanced by proper microfluidic design currently underway. The steady-state deflection was found to be related to the fPSA concentration in the solution. To check whether the deflection was caused by antigen–antibody specific binding, cantilevers containing no PSA antibody were exposed to a mixture containing 60 mug/ml of fPSA and 1 mg/ml of BSA, and the deflection was found to be negligible (see Fig. 2A). On the other hand, when cantilevers functionalized with PSA antibody were exposed to 1 mg/ml of only BSA without any fPSA, no significant cantilever deflection was observed, also indicating the high specificity of this technique. Similarly, Figure 2B shows the cantilever deflection as a function of time for different concentration of fPSA in a mixture of HSA and HP as background. To check for specificity, we again exposed fPSA to a cantilever without any PSA antibody and found negligible deflection. When a cantilever functionalized with PSA antibody was exposed to HSA and HP in the absence of fPSA, again no significant cantilever deflection was observed. This indicated the high specificity between fPSA antigen–antibody binding in the background of HSA and HP.

Figure 2: Detection of free PSA (fPSA).

Figure 2 : Detection of free PSA (fPSA).
(A) Cantilever deflection versus time for fPSA detection sensitivity against a background of 1 mg/ml of

Results (Thai) 1:

การวินิจฉัยและการตรวจสอบโรคซับซ้อนเช่นมะเร็งต้องตรวจหาปริมาณของโปรตีนหลาย งานล่าสุดได้แสดงว่า เมื่อผูกวทคร ๕๐๘ เฉพาะเกิดขึ้นบนพื้นผิวหนึ่งของแสง microcantilever, intermolecular nanomechanics งอ cantilever ซึ่งสามารถพบ optically แม้ว่าเทคนิคนี้ฟรีป้ายชื่อพร้อมยืดตัวเองการก่อตัวของอาร์เรย์ microcantilever อะไรมียังคงชัดเจนเป็นเรื่องสำคัญเทคโนโลยีไม่ว่าจะเป็นการเฉพาะ และความไวต่อการตรวจหาโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับโรคที่เงื่อนไขที่เกี่ยวข้องทางคลินิกและความเข้มข้นพอ เป็นตัวอย่าง เรารายงานที่นี่ที่ microcantilevers ของรูปทรงเรขาคณิตต่าง ๆ ถูกใช้เพื่อตรวจสอบแบบฟอร์มที่สองของการตรวจหาเฉพาะต่อมลูกหมาก (PSA) ช่วงกว้างของความเข้มข้นจาก 0.2 ng/ml การ mug 60 ml ในพื้นหลังของมนุษย์ serum albumin (HSA) และมนุษย์ plasminogen (HP) ที่ 1 mg/ml ทำให้เทคนิคการวินิจฉัยทางคลินิกที่เกี่ยวข้องสำหรับมะเร็งต่อมลูกหมาก เพราะ cantilever เคลื่อนไหวเกิดจากการเปลี่ยนแปลงพลังงานฟรีที่เหนี่ยวนำ โดยผูกเฉพาะวทคร ๕๐๘ เทคนิคนี้อาจมีแพลตฟอร์มทั่วไปสำหรับอัตราความเร็วสูงฟรีป้ายชื่อวิเคราะห์โปรตีน – โปรตีนรวม DNA hybridization และโต้ – โปรตีนดีเอ็นเอ ตลอดจนการค้นพบยาเสพติดแนะนำเป็นมากขึ้นเห็นได้ชัดว่า ระบุอัตราความเร็วสูงและการวิเคราะห์หาปริมาณของจำนวนโมเลกุลชีวภาพเป็นสิ่งสำคัญสำหรับการสร้างโพรไฟล์โมเลกุลที่สำคัญในการวินิจฉัย ติดตาม และประเมิน prognostic โรคซับซ้อนเช่น cancer1, 2 สำหรับการวิเคราะห์ทางพันธุกรรม microarrays กรดนิวคลีอิกใช้ได้ในเชิงพาณิชย์อนุญาตให้รหัสสำคัญของลำดับดีเอ็นเอพร้อมกัน สำหรับการวิเคราะห์โปรตีน ซึ่งจะเกี่ยวข้องโดยตรงสำหรับการตรวจหาโรค วิเคราะห์อัตราความเร็วสูงอย่างไรก็ตาม มี ยังคง ความท้าทาย เทคนิคการวิเคราะห์โปรตีน multiplexed ใช้สามารถทั่วไปแบ่งออกเป็นสี่ประเภท: (1) กัมมันตรังสี chemiluminescent หรือฟลูออเรสรายงานการตรวจหาแอนติบอดี – binding3, 4, 5 (2) เวลาของเที่ยวบินโดยรวม spectroscopy6 (3) separation7 ด้วย และ (4) ตรวจพบการเปลี่ยนแปลงในคุณสมบัติของพื้นผิวเนื่องจากการตรวจหาแอนติบอดี – binding8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 แม้ว่าพวกเขาทั้งหมดมีจุดแข็งแต่ละของพวกเขา พวกเขากำลังประสบจากไม่สามารถระบุ หรือ quantitate proteins7 หรือผูกเจาะจงของ analyte เซรั่มไป surface16 เซนเซอร์ Biosensors ฟรีป้ายชื่อสากลอย่างแท้จริงมีความสำคัญ และการตรวจโปรตีน analytes ในอัตราความเร็วสูงยังไม่ใช่ความจริงเอกสารล่าสุดมีรายงานการสังเกตการณ์ซึ่งเมื่อวทคร ๕๐๘ การโต้ตอบที่เกิดขึ้นบนพื้นผิวหนึ่งของแสง microcantilever, cantilever bends17, 18, 19, 20 (ดู Fig. 1) การค้นพบล่าสุดของจุดเริ่มต้นของการเคลื่อนไหว nanomechanical สร้างขึ้น โดย DNA hybridization และโปรตีนลิแกนด์ binding19 ให้เป็น specificity เทคนิค นอกจากนี้ การใช้ดีเอ็นเอดีเอ็นเอตรวจ hybridization รวมถึงถูกต้องตรวจสอบค่าบวก/ลบ mismatches หนึ่ง – ฐานคู่ ได้ยัง reported19, 20 นอกจากมีป้ายชื่อฟรี เทคโนโลยีนี้พร้อมยืดตัวเองการก่อตัวของ microarrays ใช้รู้จัก microfabrication techniques21 จึงเสนอโน้มสัญญาการวิเคราะห์โปรตีนอัตราความเร็วสูง อะไรมียังคงไม่ชัดเจน อย่างไรก็ตาม ได้ว่าเทคนิคนี้มีความไวที่จะใช้สำหรับการตรวจพบโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับโรคที่เงื่อนไขที่เกี่ยวข้องทางคลินิกและความเข้มข้นและ specificity เพียงพอ ปัญหานี้สำคัญเทคโนโลยี เราแสดงในกระดาษนี้ประยุกต์ใช้เทคนิคนี้สำคัญ และการตรวจ PSA เป็นตัวอย่างทั้งโปรตีน – โปรตีนผูกทั่วไปและตรวจหาเครื่องหมายเนื้องอกโดยเฉพาะรูปที่ 1: ไดอะแกรมของการโต้ตอบระหว่างโมเลกุลเป้าหมายและโพรบบนคาน cantileverรูปที่ 1: ไดอะแกรมของการโต้ตอบระหว่างโมเลกุลเป้าหมายและโพรบบนคาน cantileverวทคร ๕๐๘ เฉพาะการโต้ตอบระหว่างโมเลกุลเป้าหมายและโพรบเปลี่ยนแปลงโต้ตอบ intermolecular nanomechanical ภายใน monolayer ประกอบด้านหนึ่งของคาน cantilever นี้สามารถผลิตแรงพอขนาดใหญ่โค้งคาน cantilever และสร้างการเคลื่อนไหวรูปภาพขนาดเต็ม (7 KB)มะเร็งต่อมลูกหมากอยู่แบบแพร่หลายที่สุดของมะเร็งในผู้ชายและสองสาเหตุการตายเพศชายมะเร็งในสหรัฐอเมริกา PSA ที่อาสาในซีรั่มได้พิสูจน์ให้เป็นเครื่องหมายที่มีประโยชน์อย่างมากสำหรับการตรวจหามะเร็งต่อมลูกหมาก และตรวจสอบความก้าวหน้าของโรคและผลของการรักษาที่ผู้ป่วย PSA เป็นไกลโคโปรตีน kDa 33 – 34 กับรติเอส chymotrypsin เช่นกิจกรรม แบบฟอร์มนี้ enzymatically งานของ PSA แบบคอมเพล็กซ์ มีการเซรั่มรติเอสเตอร์ alpha1-antichymotrypsin (กระทำ) เพื่อสร้างแบบฟอร์มกันของ PSA ในซีรั่ม PSA ยังฟอร์มซับซ้อน กับ alpha2-macroglobulin (A2M) และอื่น ๆ ซีรั่มเอนไซม์ inhibitors แต่ degree22 น้อยมาก 23 การทดสอบ PSA ถูกจำกัด โดยการขาดการสัมพันธ์ของความถูกต้องในผู้ชายลดลงระดับ PSA ใน "วินิจฉัยสีเทาโซน" 4-10 ng/ml ความแตกต่างระหว่าง complexed PSA (cPSA) และ PSA ผูก หรือฟรี (fPSA), อย่างไรก็ตาม ได้กลายเป็นรู้จักเป็นคุณลักษณะที่เกี่ยวข้องทางคลินิกของการทดสอบ PSA ดังนั้น แม้ว่าจะอยู่ประมาณ 75 – 85% ของ PSA เป็น cPSA ในอ่อนโยน hypertrophy ของต่อมลูกหมาก (BPH), สัดส่วนเพิ่มขึ้นอยู่ระหว่าง 90 และ 100% ในมะเร็งต่อมลูกหมาก fPSA ดังนั้นที่ต่ำกว่าใน serum สูงมีโอกาส malignancy Assays วินิจฉัยใหม่ส่วนใหญ่คำนึงถึงนี้ โดยเพจป้ายคู่สำหรับวัดพร้อม ๆ กัน และ equimolar fPSA และ cPSA แม้ว่าจะมี controversies เกี่ยวกับความถี่ของการคัดกรอง proponents ตรวจคัดกรองมะเร็งต่อมลูกหมาก PSA ใช้รักษาว่า ตรวจหาสิ่งใกล้เคียงที่สุดในปัจจุบันจะเป็น cure24 ส่วนใหญ่ assays PSA ปัจจุบันเป็นรูปแบบของเอนไซม์ลิงค์ immunosorbent assays (ELISA), การแตกต่างกันในการตรวจหาอาศัยเอนไซม์ในระบบ เรืองแสง หรือ chemiluminescent ป้าย ซึ่งรายงานการจัดตั้งเฉพาะเชิงภูมิคุ้มกันของ PSA ทั่วไป สองหมด monoclonal แอนตี้ตรงกับ epitopes PSA ที่แตกต่างกันจะใช้ในรูปแบบ "แซนด์วิชวิเคราะห์" สำหรับการจับภาพและตรวจสอบ ซึ่งช่วยเพิ่มประสิทธิภาพการ specificityในเอกสารนี้ เราได้ใช้แอนติบอดีต้าน polyclonal-PSA เป็นการ "ลิแกนด์" covalently กับผิว cantilever Deflection cantilever เนื่องจากเฉพาะ fPSA ผูกกับแอนติบอดีนี้ช่วยให้เราสามารถตรวจหาความเข้มข้น fPSA จาก 0.2 ng/ml การ 60 mug/ml ซึ่งรวมถึงการเกี่ยวข้องทางคลินิกการวินิจฉัย PSA เข้มข้นช่วง เราได้สามารถตรวจพบ fPSA แม้กระทั่งกับ "เสียง" ของโปรตีนเซรั่มมนุษย์ไม่เกี่ยวข้องเช่น HP และ HSA หรือโปรตีนเซรั่ม nonhuman เช่นวัว serum albumin (บีเอสเอ), พื้นหลังจำลองซึ่งอยู่ในความเข้มข้นสูงถึง 1 mg/ml บ่งชี้ว่า เราได้สามารถบรรเทาปัญหาของสัญญาณรบกวนรวมและวิเคราะห์จาก nontarget analytes เจาะจงส่วนใหญ่ เรามียังได้บรรลุ specificity และช่วงของความไวกับ cPSA เหมือนกันด้านบนของหน้าผลและการสนทนาFigure 2A shows the cantilever deflection as a function of time for different concentrations of fPSA in a mixture with 1 mg/ml of BSA as background. The cantilevers used (see Fig. 6) in this set of experiments (Figs 2, 3) were made of silicon nitride (SiNx) with a thin coating of gold on one side and with a length of 200 mum, thickness of 0.5 mum, and each leg 20 mum wide. The gold film was used to immobilize the PSA antibody to the cantilever through thiol chemistry (see Experimental Protocol). With PSA antibody immobilized on the bottom gold surface of the cantilever, the cantilever was found always to bend up as a result of antigen–antibody binding. This is caused by the increased intermolecular repulsion between the antigen–antibody complexes on the cantilever surface. It is evident that over a time period of 3–4 h, the cantilever deflection increased and then saturated to a steady-state value. The long detection time is caused either by diffusion of molecules in the fluid cell or through conformational relaxation of the antigen–antibody complex on the cantilever surface25. The diffusion time scale, tau = L2/2D, for a fluid cell size of L approximately 0.1 cm and PSA diffusion coefficient D approximately 8.5 times 10-7 cm2/s (see Experimental Protocol), is on the order of 100 min, which is the time scale observed, making diffusion the likely candidate for the long detection time. The diffusion can be significantly enhanced by proper microfluidic design currently underway. The steady-state deflection was found to be related to the fPSA concentration in the solution. To check whether the deflection was caused by antigen–antibody specific binding, cantilevers containing no PSA antibody were exposed to a mixture containing 60 mug/ml of fPSA and 1 mg/ml of BSA, and the deflection was found to be negligible (see Fig. 2A). On the other hand, when cantilevers functionalized with PSA antibody were exposed to 1 mg/ml of only BSA without any fPSA, no significant cantilever deflection was observed, also indicating the high specificity of this technique. Similarly, Figure 2B shows the cantilever deflection as a function of time for different concentration of fPSA in a mixture of HSA and HP as background. To check for specificity, we again exposed fPSA to a cantilever without any PSA antibody and found negligible deflection. When a cantilever functionalized with PSA antibody was exposed to HSA and HP in the absence of fPSA, again no significant cantilever deflection was observed. This indicated the high specificity between fPSA antigen–antibody binding in the background of HSA and HP.รูปที่ 2: การตรวจ PSA ฟรี (fPSA)รูปที่ 2: การตรวจ PSA ฟรี (fPSA)(A) cantilever deflection เมื่อเทียบกับเวลาความไวตรวจ fPSA กับพื้นหลังของ 1 mg/ml ของ

Results (Thai) 2:

การวินิจฉัยและการตรวจสอบของโรคที่มีความซับซ้อนเช่นมะเร็งต้องมีการตรวจสอบเชิงปริมาณของโปรตีนหลาย การทำงานที่ผ่านมาได้แสดงให้เห็นว่าเมื่อชีวโมเลกุลที่มีผลผูกพันเฉพาะที่เกิดขึ้นบนพื้นผิวหนึ่งของคาน microcantilever ที่ Nanomechanics โมเลกุลโค้งเท้าแขนซึ่งสามารถตรวจพบสายตา แม้ว่าเทคนิคฉลากฟรีนี้ได้อย่างง่ายดายยืมตัวเองไปก่อตัวของอาร์เรย์ microcantilever สิ่งที่ไม่มีความชัดเจนยังคงเป็นปัญหาที่สำคัญของเทคโนโลยีไม่ว่าจะเป็นพอที่เฉพาะเจาะจงและมีความสำคัญในการตรวจสอบโปรตีนโรคที่เกี่ยวข้องกับเงื่อนไขที่เกี่ยวข้องทางคลินิกและความเข้มข้น ในฐานะที่เป็นตัวอย่างเช่นเรารายงานที่นี่ที่ microcantilevers ของรูปทรงเรขาคณิตที่แตกต่างกันได้ถูกนำมาใช้ในการตรวจสอบสองรูปแบบของแอนติเจนเฉพาะต่อมลูกหมาก (PSA) ในช่วงกว้างของความเข้มข้น 0.2 ng / ml 60 แก้ว / ml ในพื้นหลังของโปรตีนชนิดหนึ่งในซีรั่มของมนุษย์ (HSA) และ plasminogen มนุษย์ (HP) ณ วันที่ 1 มก. / มล. ทำให้นี้เป็นเทคนิคการวินิจฉัยทางคลินิกมะเร็งต่อมลูกหมาก เพราะการเคลื่อนไหวที่เท้าแขนมาจากการเปลี่ยนแปลงของฟรีพลังงานที่เกิดจากการที่เฉพาะเจาะจงชีวโมเลกุลที่มีผลผูกพันเทคนิคนี้อาจมีแพลตฟอร์มร่วมกันสำหรับฉลากฟรีสูง throughput วิเคราะห์โปรตีนผูกพันธุ์ดีเอ็นเอและการมีปฏิสัมพันธ์ดีเอ็นเอโปรตีนเช่นเดียวกับยาเสพติด การค้นพบ. บทนำมันจะกลายเป็นที่เห็นได้ชัดมากขึ้นว่าบัตรประจำตัวสูงผ่านและปริมาณของจำนวนมากของโมเลกุลทางชีวภาพเป็นสิ่งสำคัญสำหรับการสร้างโปรไฟล์โมเลกุลที่มีความสำคัญในการวินิจฉัยการตรวจสอบและประเมินผลการพยากรณ์โรคของโรคที่ซับซ้อนเช่น cancer1, 2. สำหรับ การวิเคราะห์ทางพันธุกรรมในเชิงพาณิชย์ microarrays กรดนิวคลีอนุญาตให้บัตรประจำตัวที่มีความสำคัญในพันของลำดับดีเอ็นเอพร้อมกัน สำหรับการวิเคราะห์โปรตีนซึ่งเป็นที่เกี่ยวข้องโดยตรงในการตรวจหาโรควินิจฉัยสูงผ่านได้อย่างไรยังคงเป็นความท้าทาย เทคนิคการวิเคราะห์โปรตีน Multiplexed ใช้อยู่ในปัจจุบันสามารถแบ่งออกเป็นสี่ประเภทที่แตกต่างกัน (1) กัมมันตรังสี chemiluminescent หรือรายงานเรืองแสงของ binding3 แอนติเจนและแอนติบอดี, 4, 5; (2) เวลาของเที่ยวบิน spectroscopy6 มวล (3) separation7 อิเลค; และ (4) การตรวจสอบของการเปลี่ยนแปลงในคุณสมบัติของพื้นผิวเนื่องจากการ binding8 แอนติเจนและแอนติบอดี, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 แม้ว่าพวกเขาทุกคนมีจุดแข็งของแต่ละบุคคลของพวกเขาขณะที่พวกเขาต้องทนทุกข์ทรมานทั้งจากไม่สามารถที่จะระบุตัวตนหรือ quantitate proteins7 หรือเชิญชมผลผูกพันของการวิเคราะห์ซีรั่มที่จะ surface16 เซ็นเซอร์ แท้จริงไบโอเซนเซอร์ฉลากฟรีสากลสำหรับการตรวจสอบที่สำคัญและที่เฉพาะเจาะจงของสารโปรตีนในแฟชั่นสูงผ่านยังไม่ได้เป็นความจริง. เอกสารล่าสุดมีรายงานว่ามีการสังเกตว่าเมื่อมีปฏิสัมพันธ์ชีวโมเลกุลที่เฉพาะเจาะจงเกิดขึ้นบนพื้นผิวหนึ่งของคาน microcantilever ที่ bends17 เท้าแขนที่ 18, 19, 20 (ดูรูปที่ 1). การค้นพบที่ผ่านมาของการกำเนิดของการเคลื่อนไหว nanomechanical ที่สร้างขึ้นโดยการผสมข้ามพันธุ์ DNA และ binding19 โปรตีนแกนด์ที่มีให้เข้าใจบางอย่างในความจำเพาะของเทคนิค นอกจากนี้การใช้งานสำหรับการตรวจสอบการผสมข้ามพันธุ์ดีเอ็นเอดีเอ็นเอที่ถูกต้องรวมทั้งบวก / ลบของการตรวจสอบคู่หนึ่งในฐานที่ไม่ตรงกันก็ reported19 20 นอกเหนือจากการเป็นฉลากฟรีเทคโนโลยีนี้ได้อย่างง่ายดายยืมตัวเองไปก่อตัวของ microarrays โดยใช้ชิ้นงานขนาดเล็กที่รู้จักกันดี techniques21 จึงเสนอโอกาสที่มีแนวโน้มของการส่งผ่านสูงวิเคราะห์โปรตีน ยังคงเป็นสิ่งที่ไม่ชัดเจน แต่ไม่ว่าจะเป็นเทคนิคนี้มีความจำเพาะและความไวเพียงพอที่จะใช้ในการตรวจหาโปรตีนโรคที่เกี่ยวข้องกับเงื่อนไขที่เกี่ยวข้องทางคลินิกและความเข้มข้น ที่อยู่นี้ปัญหาที่สำคัญเทคโนโลยีที่เราแสดงให้เห็นในบทความนี้ประยุกต์ใช้เทคนิคนี้มีความสำคัญและเฉพาะการตรวจสอบของ PSA เป็นตัวอย่างของทั้งสองโปรตีนที่มีผลผูกพันโดยทั่วไปและการตรวจสอบเนื้องอกโดยเฉพาะอย่างยิ่ง. รูปที่ 1: แผนผังของการมีปฏิสัมพันธ์ระหว่างเป้าหมาย . และโมเลกุลสอบสวนบนคานคานรูปที่1: แผนผังของการมีปฏิสัมพันธ์ระหว่างโมเลกุลเป้าหมายและสอบสวนบนคานคาน. เฉพาะการมีปฏิสัมพันธ์ระหว่างชีวโมเลกุลเป้าหมายและโมเลกุลสอบสวนเปลี่ยนแปลงการปฏิสัมพันธ์ระหว่างโมเลกุล nanomechanical ภายใน monolayer ตนเองประกอบบนด้านหนึ่งของคานเท้าแขน นี้สามารถผลิตแรงมากพอที่จะโค้งคานคานและสร้างการเคลื่อนไหว. ขนาดภาพเต็ม (7 KB) โรคมะเร็งต่อมลูกหมากในปัจจุบันคือรูปแบบที่แพร่หลายมากที่สุดของมะเร็งในผู้ชายและสาเหตุสำคัญที่สองของการเสียชีวิตด้วยโรคมะเร็งชายในประเทศสหรัฐอเมริกา PSA ที่ตรวจพบในซีรั่มได้พิสูจน์แล้วว่าเป็นเครื่องหมายประโยชน์มากสำหรับการตรวจหามะเร็งต่อมลูกหมากและในการตรวจสอบผู้ป่วยสำหรับการดำเนินของโรคและผลกระทบของการรักษา PSA เป็นไกลโคโปรตีน 33-34 กิโลดาลตันกับกิจกรรมโปรติเอส chymotrypsin เหมือน นี้ฟอร์มที่ใช้งานของเอนไซม์ PSA รูปแบบคอมเพล็กซ์ที่มีสารยับยั้งเอนไซม์โปรติเอซีรั่ม alpha1-antichymotrypsin (ACT) เพื่อสร้างรูปแบบที่โดดเด่นของ PSA ในซีรั่ม PSA ยังรูปแบบที่ซับซ้อนที่มี alpha2-macroglobulin (A2M) และสารยับยั้งเอนไซม์ซีรั่มอื่น ๆ แต่เป็น degree22 น้อยมาก 23. การทดสอบ PSA จะถูก จำกัด จากการขาดญาติของความถูกต้องในผู้ชายที่มีระดับ PSA ตกอยู่ใน "โซนสีเทาวินิจฉัย "4-10 ng / ml ความแตกต่างระหว่าง PSA complexed (CPSA) และ PSA หลุดหรือฟรี (fPSA) แต่ได้กลายเป็นที่ยอมรับว่าเป็นคุณลักษณะที่เกี่ยวข้องทางคลินิกของการทดสอบ PSA ดังนั้นแม้ว่าประมาณ 75-85% ของ PSA มีอยู่เป็น CPSA ในยั่วยวนเป็นพิษเป็นภัยต่อมลูกหมากโต (BPH) การเพิ่มขึ้นของสัดส่วนจะอยู่ระหว่าง 90 และ 100% ในมะเร็งต่อมลูกหมาก; จึงลดลง fPSA ในซีรั่มที่สูงกว่าโอกาสของมะเร็ง ส่วนใหญ่การตรวจวินิจฉัยใหม่เวลานี้ในบัญชีโดยการใช้มาตรการฉลากคู่สำหรับการวัดพร้อมกันและ equimolar ของ fPSA และ CPSA แม้ว่าจะมีการถกเถียงเกี่ยวกับความถี่ของการตรวจคัดกรองผู้เสนอการตรวจคัดกรองมะเร็งต่อมลูกหมาก PSA ที่ใช้ยืนยันว่าการตรวจสอบในช่วงต้นเป็นสิ่งที่ใกล้ปัจจุบัน cure24 ส่วนใหญ่ของการตรวจ PSA ในปัจจุบันมีรูปแบบของเอนไซม์ที่เชื่อมโยงการวิเคราะห์อิมมูโน (ELISA) ที่แตกต่างกันในการตรวจสอบโดยอาศัยอำนาจของทั้งเอนไซม์, เรืองแสงหรือป้าย chemiluminescent ซึ่งรายงานเกี่ยวกับการก่อตัวที่เฉพาะเจาะจงของ PSA ภูมิคุ้มกันที่ซับซ้อน โดยทั่วไปสองโคลนอลแอนติบอดีที่แตกต่างกันโดยตรงต่อ epitopes PSA ที่แตกต่างกันถูกนำมาใช้ใน "การทดสอบแซนวิช" รูปแบบสำหรับการจับภาพและการตรวจสอบซึ่งจะช่วยเพิ่มความจำเพาะ. ในบทความนี้เราได้ใช้แอนติบอดีต่อต้าน PSA โพลีเป็น "แกนด์" ที่เชื่อมโยง covalently ไปยังพื้นผิวคาน โก่งเท้าแขนเนื่องจากการ fPSA เฉพาะผูกพันกับแอนติบอดีนี้ช่วยให้เราสามารถตรวจสอบความเข้มข้น fPSA จาก 0.2 ng / ml 60 แก้ว / ml ซึ่งรวมถึง PSA วินิจฉัยทางคลินิกช่วงความเข้มข้น เราได้รับสามารถที่จะตรวจสอบ fPSA แม้กับพื้นหลังจำลอง "เสียง" ของโปรตีนในซีรั่มของมนุษย์ที่ไม่เกี่ยวข้องเช่น HP และ HSA หรือโปรตีนในซีรั่มที่ไม่ใช่มนุษย์เช่นอัลบูมิซีรั่มวัว (BSA) ซึ่งอยู่ในปัจจุบันที่ระดับความเข้มข้นสูงถึง 1 มิลลิกรัม / มิลลิลิตร . นี้แสดงให้เห็นว่าเราได้รับสามารถที่จะบรรเทาปัญหาส่วนใหญ่ของการรบกวนผูกพันและเชิญชมการทดสอบเนื่องจากการวิเคราะห์ nontarget เราได้รับยังสามารถที่จะบรรลุความจำเพาะที่คล้ายกันและช่วงของความไวกับ CPSA. ด้านบนของหน้าผลและการอภิปรายรูปที่2A แสดงให้เห็นถึงการโก่งคานเป็นหน้าที่ของเวลาสำหรับความเข้มข้นแตกต่างกันของ fPSA ในส่วนผสม 1 mg / ml ของบีเอสเอเป็นพื้นหลัง . cantilevers ที่ใช้ (ดูรูปที่. 6) ในชุดของการทดลองนี้ (มะเดื่อ 2, 3) ที่ทำจากซิลิคอนไนไตรด์ (SiNx) ด้วยการเคลือบบาง ๆ ของทองในด้านหนึ่งและมีความยาว 200 แม่, ความหนา 0.5 แม่ และแต่ละขากว้าง 20 แม่ ฟิล์มทองถูกใช้ในการคลื่อนแอนติบอดี PSA เพื่อเท้าแขนผ่านเคมี thiol (ดูการทดลอง Protocol) ด้วยแอนติบอดี PSA ตรึงบนพื้นผิวทองด้านล่างของคานที่เท้าแขนที่พบมักจะโค้งงอขึ้นเป็นผลมาจากแอนติเจนและแอนติบอดีที่มีผลผูกพัน นี้เกิดจากแรงผลักโมเลกุลที่เพิ่มขึ้นระหว่างคอมเพล็กซ์แอนติเจนและแอนติบอดีบนพื้นผิวคาน จะเห็นว่าในช่วงเวลาที่ 3-4 ชั่วโมงโก่งคานที่เพิ่มขึ้นและอิ่มตัวแล้วเป็นค่าคงที่ของรัฐ เวลาการตรวจสอบนานเกิดทั้งโดยการแพร่กระจายของโมเลกุลในเซลล์ของเหลวหรือผ่านการผ่อนคลายโครงสร้างที่ซับซ้อนแอนติเจนและแอนติบอดีใน surface25 คาน ระยะเวลาการแพร่กระจายเอกภาพ = L2 / 2D สำหรับขนาดของเซลล์ของเหลวของ L ประมาณ 0.1 ซม. และค่าสัมประสิทธิ์การแพร่ PSA D ประมาณ 8.5 ครั้ง 10-7 cm2 / วินาที (ดูการทดลอง Protocol) เป็นคำสั่งของ 100 นาทีที่ เป็นช่วงเวลาที่สังเกตทำให้การแพร่กระจายผู้สมัครที่มีแนวโน้มเป็นครั้งการตรวจสอบนาน แพร่สามารถเพิ่มอย่างมีนัยสำคัญจากการออกแบบที่เหมาะสมไมโครปัจจุบันก้าวหน้า โก่งมั่นคงของรัฐพบว่าจะเกี่ยวข้องกับความเข้มข้น fPSA ในการแก้ปัญหา เพื่อตรวจสอบว่าการแอ่นตัวที่เกิดจากแอนติเจนและแอนติบอดีที่เฉพาะเจาะจงผูกพัน cantilevers ที่มีแอนติบอดี PSA ไม่ได้สัมผัสกับส่วนผสมที่มี 60 แก้ว / มิลลิลิตร fPSA และ 1 มิลลิกรัม / มิลลิลิตรบีเอสเอและโก่งก็พบว่ามีเพียงเล็กน้อย (ดูรูป . 2A) ในทางกลับกันเมื่อ cantilevers ฟังก์ชันที่มีแอนติบอดี PSA ได้สัมผัสกับ 1 mg / ml ของบีเอสเอเพียง แต่ไม่มี fPSA ใด ๆ ไม่โก่งเท้าแขนที่สำคัญพบว่ายังแสดงความจำเพาะสูงของเทคนิคนี้ ในทำนองเดียวกันรูปที่ 2B แสดงให้เห็นถึงการโก่งคานเป็นหน้าที่ของเวลาสำหรับความเข้มข้นแตกต่างกันของ fPSA ในส่วนผสมของ HSA และ HP เป็นพื้นหลัง เพื่อตรวจสอบความจำเพาะเราสัมผัสอีกครั้งเพื่อ fPSA เท้าแขนที่ไม่มีแอนติบอดี PSA ใด ๆ และพบว่าการโก่งเล็กน้อย เมื่อเท้าแขนฟังก์ชันที่มีแอนติบอดี PSA ได้สัมผัสกับ HSA และ HP ในกรณีที่ไม่มี fPSA อีกครั้งไม่มีการโก่งเท้าแขนที่สำคัญพบว่า นี้แสดงให้เห็นความจำเพาะสูงระหว่าง fPSA แอนติเจนและแอนติบอดีที่มีผลผูกพันในพื้นหลังของ HSA และเอชพี. รูปที่ 2:. ตรวจ PSA ฟรี (fPSA) รูปที่ 2:. ตรวจ PSA ฟรี (fPSA) (A) โก่งเท้าแขนเมื่อเทียบกับเวลาสำหรับ fPSA ความไวของการตรวจสอบกับพื้นหลังของ 1 mg / ml ของ