Abstract Pichia kudriavzevii DMKU 3

Abstract Pichia kudriavzevii DMKU 3-ET15 was
isolated from traditional fermented pork sausage by an
enrichment technique in a yeast extract peptone
dextrose (YPD) broth, supplemented with 4 % (v/v)
ethanol at 40 C and selected based on its ethanol
fermentation ability at 40 C in YPD broth composed
of 16 % glucose, and in a cassava starch hydrolysate
medium composed of cassava starch hydrolysate
adjusted to 16 % glucose. The strain produced ethanol
from cassava starch hydrolysate at a high temperature
up to 45 C, but the optimal temperature for ethanol
production was at 40 C. Ethanol production by this
strain using shaking flask cultivation was the highest
in a medium containing cassava starch hydrolysate
adjusted to 18 % glucose, 0.05 % (NH4)2SO4, 0.09 %
yeast extract, 0.05 % KH2PO4, and 0.05 % MgSO4
7H2O, with a pH of 5.0 at 40 C. The highest ethanol
concentration reached 7.86 % (w/v) after 24 h, with
Materials and methods
Isolation of thermotolerant yeast strains
Yeasts were isolated from soils and traditional
fermented foods collected from various areas in
Thailand. Isolation was carried out at 40 C by an
enrichment technique using yeast extract peptone
dextrose (YPD) broth containing 1 % yeast extract,
2 % peptone, and 2 % glucose, supplemented with
4 % (v/v) ethanol, 0.025 % sodium propionate, and
0.02 % chloramphenicol. Two grams of soil or
fermented food were aseptically placed in 250-ml
Erlenmeyer flasks containing 50 ml enrichment broth
and incubated at 40 C on a rotary shaker (Bio-Shaker
BR-300LF; Taitec, Japan) at 150 rpm for 2 days. A
loopful of the enriched culture was streaked on an agar
plate containing the same medium and incubated at
40 C until yeast colonies appeared. Yeast colonies
were picked up and purified by cross-streaking on
YPD agar. Purified yeast strains were suspended in
YPD broth, supplemented with 10 % glycerol and
maintained at -80 C.
Screening of thermotolerant yeasts for ethanol
production at high temperature
Screening of yeast strains for high ethanol production
was carried out at 40 C for three steps in YPD broth
containing 16 % glucose. Two replications were performed
in all experiments. In the first screening, ethanol
fermentation was carried out using a Durham fermentation
tube inoculated with 18–24 h culture grown on a
slant of YPD, and statically incubated for 48 h. The gas
in the Durham tube was observed, and the strains that
filled the Durham tube with gas were selected. In the
578 Antonie van Leeuwenhoek (2013) 103:577–588
123
secondary screening, ethanol production was carried out
in 250-ml Erlenmeyer flasks containing 100 ml of YPD
broth containing 16 % glucose. The inoculum was
prepared by transferring one loopful of 18–24 h culture
grown on a slant of YPD agar to a 125-ml Erlenmeyer
flask containing 20 ml of YPD broth. After incubation
on a rotary shaker at room temperature (27 ± 3 C) for
18–24 h, the pre-cultivated volume of inoculum was
transferred to the screening medium, to give an initial
cell concentration determined as having optical density
(OD) at 600 nm of 0.5, and then incubated on a rotary
shaker at 100 rpm and 40 C for 48 h. In the third
screening, the same medium and cultivation conditions
as in the secondary screening were used, but the
fermenting broth was analyzed for growth and ethanol
production at 6-h intervals.
Preparation of cassava starch hydrolysate medium
Cassava starch hydrolysate was prepared by two-step
enzymatic hydrolysis of cassava starch. For liquefaction,
a modification of the method of Aremu et al. (2010) was
used. The slurry of cassava starch 25 %(w/v) prepared in
distilled water was adjusted to pH 6.5 and then 0.2 %
(w/v) calcium chloride was added. Then, 0.1 % (w/v) of
alpha-amylase (TermamylSC DS, 240 KNU-S/g;
Novozymes, Denmark) was added, and the mixture
was hydrolyzed at 90–100 Cfor 2 h with mild agitation.
After liquefaction, the mixture was immediately cooled
to 60 C and the pH was adjusted to 4.5 with 1.0 N
H2SO4. For saccharification, 0.1 % (w/v) amylo-glucosidase
(Spirizyme Fuel, 750 AGU/g; Novozymes) was
added. The mixture was incubated with agitation at
60 C for 20 h. The enzyme reaction was stopped by
placing themixture in boiling water (100 C) for 20 min
and the precipitate was removed from the hydrolysate by
centrifugation at 7,000 rpm for 20 min. The hydrolysate
was quantified for glucose concentration by highperformance
liquid chromatography (HPLC) (LCMS-
2010A system; Shimadzu, Japan) equipped with a
refractive index (RI) detector and a sugar column
(ULTRON PS-80; Shinwa Chemical Industries, Japan).
Screening of thermotolerant yeasts for ethanol
production at high temperature from cassava starch
hydrolysate
Screening for high ethanol fermenting strains was
conducted in duplicate at 40 C in 250- and 500-ml
Erlenmeyer flasks containing 100 and 200 ml of a
cassava starch hydrolysate medium, res

Results (Thai) 1:

เป็นนามธรรม Pichia kudriavzevii DMKU 3-ET15แยกจากไส้กรอกแหนมแบบดั้งเดิมโดยการเทคนิคการเพิ่มคุณค่าใน peptone เป็นสารสกัดจากยีสต์เดกซ์โทรส (YPD) ซุป เสริม ด้วย 4% (v/v)เอทานอลที่ 40 C และเลือกอิงของเอทานอลประกอบด้วยความสามารถในการหมักที่ 40 C ในซุป YPD16% น้ำตาลกลูโคส และ ในการฉีดด้วยแป้งมันสำปะหลังขนาดกลางที่ประกอบด้วยแป้งมันสำปะหลังปรับกลูโคสในเลือด 16% เอทานอลผลิตสายพันธุ์จากการฉีดด้วยแป้งมันสำปะหลังที่อุณหภูมิสูงถึง 45 C แต่อุณหภูมิที่เหมาะสมสำหรับเอทานอลการผลิตคือเวลาการผลิตเอทานอล 40 c นี้สายพันธุ์ที่ใช้เพาะปลูกหนาวสั่นมาในสื่อที่ประกอบด้วยการฉีดด้วยแป้งมันสำปะหลังปรับกลูโคสในเลือด 18%, 0.05% (NH4) 2SO4, 0.09%สารสกัดจากยีสต์ 0.05% KH2PO4 และ 0.05% MgSO47H2O มีค่า pH 5.0 ที่ 40 c นอลสูงสุดความเข้มข้นถึง 7.86% (w/v) หลังจาก 24 ชม. พร้อมวัสดุและวิธีการแยกของสายพันธุ์ยีสต์ thermotolerantยีสต์ที่แยกจากดิน และแบบดั้งเดิมอาหารหมักดองที่เก็บจากบริเวณต่าง ๆไทย แยกที่ 40 C โดยดำเนินการเทคนิคการตกแต่งที่ใช้ peptone สารสกัดจากยีสต์เดกซ์โทรส (YPD) น้ำซุปที่ประกอบด้วยสารสกัดจากยีสต์ 1%2% peptone และ 2% กลูโคส เสริมด้วยเอทานอล 4% (v/v) propionate โซเดียม 0.025% และ0.02% คคัส สองกรัมของดิน หรืออาหารหมัก aseptically ไว้ใน 250 มิลลิลิตรErlenmeyer ขวดที่ประกอบด้วยน้ำซุปเพิ่มคุณค่า 50 มล.และรับการกกที่ 40 C บนที่ปั่นโรตารี่ (Bio-ปั่นBR-300LF Taitec ประเทศญี่ปุ่น) ที่ 150 rpm เป็นเวลา 2 วัน Aloopful ของวัฒนธรรมอุดมคือลายบนวุ้นการจานที่ประกอบด้วยขนาดกลาง และรับการกกที่เดียว40 C จนกระทั่งยีสต์อาณานิคมปรากฏ อาณานิคมของยีสต์ถูกดัก และบริสุทธิ์ โดยการวิ่งข้ามบนYPD วุ้น สายพันธุ์ยีสต์บริสุทธิ์ถูกหยุดชั่วคราวในYPD ซุป เสริม ด้วย 10% กลีเซอรอล และ-80 C.การคัดกรองของยีสต์ thermotolerant สำหรับเอทานอลการผลิตที่อุณหภูมิสูงคัดเลือกสายพันธุ์ยีสต์สำหรับผลิตเอทานอลสูงดำเนินการใน 40 C สำหรับขั้นตอนที่สามในซุป YPDประกอบด้วยกลูโคส 16% ดำเนินการสองระยะในการทดลองทั้งหมด ในการคัดกรองครั้งแรก เอทานอลหมักได้ดำเนินการโดยใช้การหมัก Durhamหลอด inoculated กับวัฒนธรรม 18 – 24 ชม.ที่ปลูกในเอียงของ YPD และได้รับการกก statically สำหรับ 48 ชั่วโมง ก๊าซเดอรัมพบว่า หลอด และสายพันธุ์ที่เติม Durham เลือกหลอดที่ มีก๊าซ ใน103:577 Antonie van Leeuwenhoek (2013) 578-588123รองคัดกรอง การผลิตเอทานอลได้ดำเนินการในขวด Erlenmeyer 250 มิลลิลิตรบรรจุ 100 ml ของ YPDน้ำซุปที่ประกอบด้วยกลูโคส 16% Inoculum ถูกจัดทำโดย loopful หนึ่งของวัฒนธรรม 18 – 24 ชมเติบโตในลักษณะเอียงของวุ้น YPD ใน Erlenmeyer 125 มิลลิลิตรขวดบรรจุ 20 ml ของน้ำซุป YPD หลังจากบ่มในการปั่นโรตารีที่ห้องอุณหภูมิ (27 ± 3 C)คือก่อนปลูกปริมาณ inoculum 18 – 24 ชม.การคัดกรองสื่อ ให้มีการเริ่มต้นความเข้มข้นของเซลล์ที่กำหนดมีความหนาแน่นออปติคอล(OD) ที่ 600 nm 0.5 และได้รับการกกแล้ว ในโรตาปั่น 100 รอบต่อนาทีและ 40 C สำหรับ 48 ชั่วโมง ในที่สามคัดกรอง กลางเดียวกัน และสภาวะการเพาะปลูกในการคัดกรองรองใช้ แต่หมักน้ำซุปคือวิเคราะห์ความเจริญเติบโตและเอทานอลการผลิตในช่วงเวลา 6 ชมการเตรียมสารด้วยแป้งมันสำปะหลังการฉีดด้วยแป้งมันสำปะหลังได้จัดทำขึ้นสองขั้นตอนเอนไซม์ย่อยสลายแป้งมันสำปะหลัง สำหรับ liquefactionมีการเปลี่ยนแปลงของวิธีของ Aremu et al. (2010)ใช้ สารละลายของมันสำปะหลังแป้ง %(w/v) 25 ในน้ำกลั่นปรับปรุง pH 6.5 และ 0.2%(w/v) แคลเซียมคลอไรด์ถูก แล้ว 0.1% (w/v)อัลฟาอะไมเลส (Termamyl SC DS, 240 KNU-S/gNovozymes เดนมาร์ก) ถูกเพิ่ม และส่วนผสมแก้ไขไลซ์ที่ 90 – 100 Cfor 2 h กับความปั่นป่วนรุนแรงหลังจาก liquefaction ความร้อนผสมทันทีถูกปรับปรุงเป็น 4.5 ด้วย 1.0 N 60 C และ pHH2SO4 สำหรับ saccharification, amylo-glucosidase 0.1% (w/v)(Spirizyme เชื้อเพลิง AGU 750/g แก้ไข Novozymes)เพิ่ม ส่วนผสมมี incubated มีความปั่นป่วนที่60 C สำหรับ 20 h หยุดปฏิกิริยาเอนไซม์โดยวาง themixture ในน้ำเดือด (100 C) 20 นาทีและตะกอนถูกเอาออกจากฉีดโดยหมุนเหวี่ยงที่ 7,000 รอบต่อนาที 20 นาที การฉีดด้วยวัดสำหรับความเข้มข้นของน้ำตาลกลูโคส โดย highperformanceของเหลว chromatography (HPLC) (LCMS-ระบบ 2010A Shimadzu ญี่ปุ่น) พร้อมกับการหัวตรวจวัดดัชนีหักเห (RI) และคอลัมน์น้ำตาล(ซี๊ด PS-80 Shinwa อุตสาหกรรมเคมี ญี่ปุ่น)การคัดกรองของยีสต์ thermotolerant สำหรับเอทานอลการผลิตที่อุณหภูมิสูงจากแป้งมันสำปะหลังการฉีดด้วยเป็นการตรวจหาสายพันธุ์หมักเอทานอสูงดำเนินการซ้ำที่ 40 C ใน 250 - และ 500 มล.Erlenmeyer ขวดประกอบด้วย 100 และ 200 ml ของการแป้งมันสำปะหลังด้วยความละเอียดขนาดกลาง

Results (Thai) 2:

บทคัดย่อ Pichia kudriavzevii DMKU 3 ET15 ถูก
แยกออกจากแบบดั้งเดิมไส้กรอกหมูหมักโดย
ใช้เทคนิคการเพิ่มคุณค่าในสารสกัดจากยีสต์เปปโตน
เดกซ์โทรส (YPD) น้ำซุปเสริมด้วย 4% (v / v)
เอทานอลที่ 40 องศาเซลเซียสและเลือกขึ้นอยู่กับเอทานอลของ
การหมัก ความสามารถที่ 40 องศาเซลเซียสในน้ำซุป YPD ประกอบด้วย
กลูโคส 16% และในไฮโดรไลแป้งมันสำปะหลัง
กลางประกอบด้วยไฮโดรไลแป้งมันสำปะหลัง
ปรับให้น้ำตาลกลูโคส 16% สายพันธุ์ที่ผลิตเอทานอล
จากไฮโดรไลแป้งมันสำปะหลังที่อุณหภูมิสูง
ถึง 45 องศาเซลเซียส แต่อุณหภูมิที่เหมาะสมสำหรับเอทานอล
ที่ผลิตอยู่ที่ 40 องศาเซลเซียส การผลิตเอทานอลจากนี้
สายพันธุ์โดยใช้เขย่าเพาะปลูกขวดเป็นระดับสูงสุด
ในสื่อที่มีไฮโดรไลแป้งมันสำปะหลัง
ปรับให้น้ำตาลกลูโคส 18%, 0.05% (NH4) 2SO4 0.09%
สารสกัดจากยีสต์, 0.05% KH2PO4 และ 0.05% MgSO4?
7H2O ด้วย ค่า pH 5.0 ที่ 40 องศาเซลเซียส เอทานอลที่สูงที่สุด
มีความเข้มข้นถึง 7.86% (w / v) หลังจาก 24 ชั่วโมงกับ
วัสดุและวิธี
การแยกยีสต์ทนร้อนสายพันธุ์
ยีสต์ที่แยกได้จากดินและแบบดั้งเดิม
อาหารหมักดองที่เก็บได้จากพื้นที่ต่างๆใน
ประเทศไทย แยกได้ดำเนินการที่ 40 องศาเซลเซียสโดย
ใช้เทคนิคการเพิ่มปริมาณการใช้สารสกัดจากยีสต์เปปโตน
เดกซ์โทรส (YPD) น้ำซุปที่มีส่วนผสมของสารสกัดจาก 1% ยีสต์
เปปโตน 2% และกลูโคส 2% เสริมด้วย
4% (v / v) เอทานอล, 0.025% โซเดียม propionate และ
0.02% chloramphenicol สองกรัมของดินหรือ
อาหารหมักถูกวางปลอดเชื้อใน 250 มล.
ขวด Erlenmeyer มี 50 มล. น้ำซุปเพิ่มปริมาณ
และบ่มที่ 40 C ในเครื่องปั่นแบบหมุน (Bio-Shaker?
BR-300LF; Taitec ญี่ปุ่น) ที่ 150 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 2 วัน
loopful ของวัฒนธรรมที่อุดมถูกลายบนวุ้น
แผ่นที่มีขนาดกลางเดียวกันและบ่มที่อุณหภูมิ
40 องศาเซลเซียสจนอาณานิคมยีสต์ปรากฏ อาณานิคมยีสต์
ถูกหยิบขึ้นมาและทำให้บริสุทธิ์โดยข้ามลายเส้นบน
YPD วุ้น สายพันธุ์ยีสต์บริสุทธิ์ถูกระงับใน
YPD น้ำซุปเสริมด้วยกลีเซอรีน 10% และ
เก็บรักษาไว้ที่ -80 องศาเซลเซียส.
การคัดกรองของยีสต์ทนร้อนเอทานอล
ผลิตที่อุณหภูมิสูง
การคัดเลือกสายพันธุ์ยีสต์สำหรับการผลิตเอทานอลสูง
ได้ดำเนินการที่ 40 องศาเซลเซียสเป็นสามขั้นตอน ใน YPD น้ำซุป
ที่มีส่วนผสมของน้ำตาลกลูโคส 16% สองซ้ำได้ดำเนินการ
ในทุกการทดลอง ในการตรวจคัดกรองครั้งแรกที่เอทานอล
การหมักได้ดำเนินการโดยใช้การหมักเดอร์แฮม
หลอดเชื้อด้วย 18-24 วัฒนธรรม H เติบโตบน
เอียงของ YPD และบ่มแบบคงที่เป็นเวลา 48 ชั่วโมง ก๊าซ
ในหลอดเดอร์แฮมเป็นที่สังเกตและสายพันธุ์ที่
เต็มไปเดอร์แฮมท่อก๊าซได้รับการคัดเลือก ใน
578 Antonie Van Leeuwenhoek (2013) 103: 577-588
123
การตรวจคัดกรองรองผลิตเอทานอได้ดำเนินการ
ในขวด 250 มิลลิลิตร Erlenmeyer มี 100 มิลลิลิตร YPD
น้ำซุปที่มีส่วนผสมของน้ำตาลกลูโคส 16% เชื้อได้รับการ
จัดทำขึ้นโดยการโอนหนึ่ง loopful 18-24 วัฒนธรรม H
ปลูกบนเอียงของ YPD วุ้นไปยัง 125 มล. Erlenmeyer
ขวดมี 20 มิลลิลิตร YPD น้ำซุป หลังจากการบ่ม
ในเครื่องปั่นแบบหมุนที่อุณหภูมิห้อง (27 ± 3 องศาเซลเซียส) สำหรับ
18-24 ชั่วโมงปริมาณก่อนการเพาะปลูกของเชื้อได้รับการ
ถ่ายโอนไปยังสื่อการตรวจคัดกรองเพื่อให้เริ่มต้น
ความเข้มข้นของเซลล์กำหนดว่ามีความหนาแน่นของแสง
(OD) ที่ 600 นิวตันเมตร 0.5 แล้วบ่มในแบบหมุน
ปั่นที่ 100 รอบต่อนาทีและ 40 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 48 ชั่วโมง ในไตรมาสที่สาม
การตรวจคัดกรองสื่อและการเพาะปลูกเดียวกันเงื่อนไข
เช่นเดียวกับในการตรวจคัดกรองรองถูกนำมาใช้ แต่
น้ำซุปหมักได้รับการวิเคราะห์การเจริญเติบโตและเอทานอล
ที่ผลิตในช่วงเวลา 6 ชม.
เตรียมแป้งมันสำปะหลังไฮโดรไลกลาง
ไฮโดรไลแป้งมันสำปะหลังถูกจัดทำขึ้นโดยสอง ขั้นตอนที่
ย่อยโปรตีนของแป้งมันสำปะหลัง สำหรับเหลว,
การเปลี่ยนแปลงของวิธีการ Aremu et al, (2010) ถูก
นำมาใช้ สารละลายแป้งมันสำปะหลัง 25% (w / v) จัดทำใน
น้ำกลั่นปรับค่า pH 6.5 แล้ว 0.2%
(w / v) แคลเซียมคลอไรด์ถูกเพิ่มเข้ามา จากนั้น 0.1% (w / v) ของ
อัลฟาอะไมเลส (เอนไซม์ Termamyl SC DS 240 KNU-S / g?
Novozymes, เดนมาร์ก) ถูกบันทึกและส่วนผสมที่
ได้รับการไฮโดรไลซ์ที่ 90-100 Cfor 2 ชั่วโมงกับการกวนอ่อน?
หลังจากเหลวส่วนผสมที่ถูกทำให้เย็นทันที
ถึง 60 องศาเซลเซียสและมีค่า pH ที่ถูกปรับ 4.5 กับ 1.0 N
H2SO4 สำหรับ saccharification 0.1% (w / v) amylo-glucosidase
(Spirizyme เชื้อเพลิง 750 AGU / g? Novozymes) คือการ
เพิ่ม ส่วนผสมที่ถูกบ่มกับความปั่นป่วนที่
60 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 20 ชั่วโมง ปฏิกิริยาเอนไซม์หยุด
วาง themixture ในน้ำ (100? C) เดือด 20 นาที
และตะกอนถูกลบออกจากไฮโดรไลโดย
การหมุนเหวี่ยงที่ 7,000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 20 นาที ไฮโดรไลเซ
ได้รับการวัดความเข้มข้นของน้ำตาลกลูโคสโดย highperformance
ของเหลว chromatography (HPLC) (LCMS-
ระบบ 2010A; Shimadzu, ญี่ปุ่น) พร้อมกับ
ดัชนีหักเห (RI) เครื่องตรวจจับและเสาน้ำตาล
(Ultron PS-80; Shinwa อุตสาหกรรมเคมี, ญี่ปุ่น)
การตรวจคัดกรองยีสต์ทนร้อนเอทานอล
ผลิตที่อุณหภูมิสูงจากแป้งมันสำปะหลัง
ไฮโดรไล
คัดกรองสำหรับสายพันธุ์ที่หมักเอทานอลสูง
ดำเนินการในที่ซ้ำกันที่ 40 องศาเซลเซียสใน 250 และ 500 มิลลิลิตร
Erlenmeyer ขวดมี 100 และ 200 มล. ของ
กลางไฮโดรไลแป้งมันสำปะหลังละเอียด

Results (Thai) 3:

pichia kudriavzevii DMKU 3-et15 เป็นนามธรรมที่แยกได้จากไส้กรอกหมูหมักแบบดั้งเดิมโดยเทคนิคเสริมในการ extract สารสกัดจากยีสต์เดกซ์โทรส ( ypd ) น้ำซุปเติม 4 เปอร์เซ็นต์ ( v / v )เอทานอลที่อุณหภูมิ 40 องศาเซลเซียส และที่เลือกบนพื้นฐานของเอทานอลและความสามารถที่ 40 องศาเซลเซียสในน้ำซุป ypd ประกอบด้วยกลูโคส 16 % และในแป้งมันสำปะหลังไฮโดรไลเซทกลางประกอบด้วยจากแป้งมันสำปะหลังปรับให้กลูโคส 16 % สายพันธุ์ที่ผลิตเอทานอลจากจากแป้งมันสำปะหลังที่อุณหภูมิสูงถึง 45 องศาเซลเซียส แต่อุณหภูมิที่เหมาะสมสำหรับเอทานอลการผลิตอยู่ที่ 40 องศาเซลเซียส การผลิตเอทานอล โดยนี้เขย่าขวดเพาะสายพันธุ์โดยใช้เป็นสูงสุดในอาหารที่มีจากแป้งมันสำปะหลังปรับให้กลูโคสร้อยละ 18 , 0.05 % ( NH4 ) 2so4 0.09 %สารสกัดจากยีสต์ , 0.05 % kh2po4 และ 0.05 % MgSO4 ใ7h2o ที่มี pH 5.0 เอทานอลสูงสุด 40 องศาเซลเซียสความเข้มข้นสูงถึง 7.86 % ( w / v ) หลังจาก 24 ชั่วโมง กับวัสดุและวิธีการการคัดเลือกสายพันธุ์ยีสต์ทนยีสต์ที่แยกได้จากดินและแบบดั้งเดิมอาหารหมักที่รวบรวมจากหลายพื้นที่ในประเทศไทย การกระทำที่ 40 C จากการใช้เทคนิค extract สารสกัดจากยีสต์เดกซ์โทรส ( ypd ) อาหารที่มีสารสกัดจากยีสต์ 1 %2 % ตามลำดับ และ 2% กลูโคส เสริมด้วย4 เปอร์เซ็นต์ ( v / v ) เอทานอล , 0.025 % โซเดียม propionate , และ0.02 % ของส . สองกรัมของดินหรืออาหารหมักเป็น aseptically วางไว้ใน 250 ml .ขวดบรรจุ 50 ml enrichment broth เออร์เลนเมเยอร์บ่มที่อุณหภูมิ 40 องศาเซลเซียสและในเครื่องปั่น rotary shaker ( ไบโอbr-300lf ; taitec ญี่ปุ่น ) ที่ความเร็ว 150 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 2 วัน เป็นloopful ของอุดมวัฒนธรรมเป็นลายบนวุ้นจานที่มีขนาดเดียวกันและบ่มที่40 C จนกระทั่งโคโลนียีสต์ขึ้น โคโลนีของยีสต์ถูกเลือกขึ้นและทำให้บริสุทธิ์ โดย streaking บนกางเขนypd วุ้น ยีสต์สายพันธุ์บริสุทธิ์ที่ถูกระงับในซุป ypd เสริมด้วย 10% และกลีเซอรอลยังคงที่ - 80 องศาเซลเซียสการคัดเลือกยีสต์ทนเอทานอลผลิตที่อุณหภูมิสูงการคัดเลือกสายพันธุ์ยีสต์สำหรับการผลิตเอทานอลสูงดำเนินการใน 40 C สามขั้นตอนในน้ำซุป ypdที่ประกอบด้วยกลูโคส 16 % สองซ้ำได้ตลอดการทดลอง ในการคัดกรองก่อน เอทานอลและทำการหมักโดยใช้เดอแรมหลอดที่ใส่ 18 – 24 ชั่วโมง เติบโตในวัฒนธรรมความคิดเห็นของ ypd และบ่ม 48 ชั่วโมง ด้วยแก๊สในท่อเดอแรมและสายพันธุ์ที่พบว่าเต็มหลอด Durham กับก๊าซที่ถูกคัดเลือก ในเป็นนักมวยไทยแบ่งตามสัญชาติ ( 2013 ) 103:577 –คุณ123ระดับการผลิตเอทานอลโดยใช้การคัดกรองหมักในฟลาสก์ขนาด 250 มิลลิลิตร ขวดบรรจุ 100 มิลลิลิตร ypdอาหารที่มีกลูโคส 16 % เชื้อ คือเตรียมย้ายหนึ่งของวัฒนธรรม loopful 18 – 24 ชั่วโมงปลูกบนลาดเอียงของ ypd วุ้นกับเออร์เลนเมเยอร์ 125 มล.ขวดบรรจุ 20 ml ของน้ำซุป ypd . หลังจากบ่มในเครื่องปั่นหมุนที่อุณหภูมิห้อง ( 27 ± 3 องศาเซลเซียส18 – 24 ชั่วโมง ก่อนปลูก ปริมาณของเชื้อ คือย้ายไปฉายกลาง ให้เริ่มต้นเซลล์ความเข้มข้นมุ่งมั่นอย่างมีความหนาแน่นของแสง( OD ) ที่ 600 nm ที่ 0.5 แล้วบ่มในโรตารีเครื่องปั่นที่ 100 รอบต่อนาทีและ 40 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 48 ชั่วโมง ในปีที่สามการคัดกรอง แบบปานกลาง และการปลูก สภาพในการคัดกรองรอง ใช้ แต่หมักน้ำวิเคราะห์เพื่อการเจริญเติบโตและเอทานอลการผลิตในช่วงเวลา 6-h .การเตรียมแป้งมันสำปะหลังไฮโดรไลเซทขนาดกลางจากแป้งมันสำปะหลังเตรียมแบบสองขั้นตอนย่อยด้วยเอนไซม์จากมันสำปะหลัง , สำหรับ ,การเปลี่ยนแปลงของวิธีการ aremu et al . ( 2010 ) คือใช้ ความเข้มข้นของแป้ง 25 % ( w / v ) ที่เตรียมไว้ในน้ำกลั่นปรับพีเอช 6.5 และ 0.2%( w / v ) แคลเซียมคลอไรด์คือเพิ่ม แล้ว 0.1% ( w / v ) ของแอลฟาอะไมเลส ( termamylsc DS , 240 knu-s / G ;กุ้ง , เดนมาร์ก ) คือการเพิ่มและผสมถูกไฮโดรไลซ์ที่ 90 – 100 C เป็นเวลา 2 ชั่วโมง ไม่รุนแรง เขย่าหลังจากการแปรรูป ผสมได้ทันทีด้วย60 C และ pH ปรับ 4.5 1.0 Nกรดซัลฟิวริก . สำหรับ saccharification 0.1% ( w / v ) อะมิโลกลูโคซิเดส( spirizyme เชื้อเพลิง , 750 AGU / g ; กุ้ง )เพิ่ม ส่วนผสมจะถูกบ่มด้วยการกวนที่60 C เป็นเวลา 20 ชั่วโมง เอนไซม์ปฏิกิริยาหยุดโดยการวาง themixture ต้มในน้ำเดือด 100 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 20 นาทีและตะกอนจะถูกลบออกจากไฮโดรไลเซทโดยปั่นที่ 7000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 20 นาทีตามลำดับคือปริมาณความเข้มข้นของกลูโคส โดย highperformanceของเหลว chromatography ( HPLC ) - ( หรือระบบ 2010a ; Shimadzu ญี่ปุ่น ) พร้อมดัชนีหักเหของแสง ( RI ) ตรวจจับ และน้ำตาล คอลัมน์( ลทรอน ps-80 ; ชินฮวาเคมีอุตสาหกรรม ญี่ปุ่น )การคัดเลือกยีสต์ทนเอทานอลผลิตที่อุณหภูมิสูงจากแป้งมันสำปะหลังไฮโดรไลเซทการคัดเลือกสายพันธุ์คือการหมักเอทานอลสูงดำเนินการในซ้ำที่ 40 C 250 - 500 มล.เออร์เลนเมเยอร์ขวดที่มี 100 และ 200 ml ของแป้งมันสำปะหลังไฮโดรไลเซทกลาง โลว์