Methods were published for Western

Methods were published for Western blot (1), exposure of cells to UV radiation (5), treatment with H2O2 (20), analysis of cells in mitosis (6), immunostaining, and analysis of brightness of γH2AX foci by laser-scanning cytometry (LSC) (5). More details are included in SI Materials and Methods, as are details of doses and timing of drug application, analysis of gene density at genomic locations enriched with γH2AX-immunoprecipitated sequence tags, and analysis of expected distribution of DNA fragment sizes, based on genomic locations of γH2AX ChIP-Seq peaks.

Cell Culture. mIMCD3 cells (35) were grown in medium containing 45% DME Low Glucose (Invitrogen), 45% F12 Coon's Modification (No. F6636; Sigma), and 10% FBS (HyClone). Osmolality of control medium was 300–320 mosmol/kg. High NaCl medium was prepared by adding NaCl to the total osmolality of 500 mosmol/kg. All of the experiments were performed on logarithmically growing cells at ≈80% confluence. To elevate NaCl, control medium was replaced by the high NaCl media.
Analysis of Double-Strand and Single-Strand DNA Breaks by Comet Assay. Two different assays were used: neutral comet assay modified for detection of double-strand breaks and alkaline comet assay, which detects DNA SSBs, double-strand breaks, and alkali-labile sites. Those assays were performed as described (19) with minor modifications. See SI Materials and Methods and Fig. S4 for details.
ChIP and Illumina Library Construction for Sequencing. ChIP was performed by using Enzymatic Chromatin IP kit (No. 9003; Cell Signaling Technology). Conversion of the ChIP-enriched DNA into libraries suitable for sequencing using the Illumina Genome Analyzer was performed by using the published protocol (36). See SI Materials and Methods and Fig. S4 for the detailed ChIP-Seq protocol.
Solexa Pipeline Analysis. Sequence tags were obtained and mapped to the mouse genome by using the Solexa Analysis Pipeline as described (37). The unique reads were retained and converted to browser extensible data (BED) files for viewing the data in the UCSC genome browser. The read number and genomic coordinates were summarized in 300-bp windows.
Analysis of DNA Fragmentation by PFGE. Agarose embedded DNA was prepared by using the CHEF Mammalian Genomic DNA Plug Kit (No. 170–3591; Bio-Rad). Briefly, cells were rinsed with PBS, scraped off the dish, resuspended in 1% CleanCut Agarose from the kit at a final concentration of 12 million cells/mL. The agarose/cell suspension was solidified at 4 °C for 10 min in a casting mold, followed by incubation of the agarose plugs in Proteinase K solution at 50 °C for 3 d to digest proteins. PFGE was performed as described (28) by using the CHEF-DR II system (Bio-Rad) and the following parameters: 1% Megabase Agarose (No. 161–3108; Bio-Rad), 0.5× TBE running buffer, 120° reorientation angle, 6 V⋅cm−1, and 14 °C. Gels were run for 16 h with switch time of 16 s, followed by 30-h run with switch time of 80 s DNA Size Markers were as follows: Schizosaccharomyes pombe, Saccharomyces cerevisiae, and Hansenula wingei chromosomes (Bio-Rad). Gels were stained with SYBR Gold (Invitrogen).

Results (Thai) 1:

วิธีเผยแพร่ในตะวันตกคืนในตา (1), ความเสี่ยงของเซลล์กับรังสี (5), รักษา ด้วย H2O2 (20), วิเคราะห์เซลล์ไมโทซิส (6), immunostaining และการวิเคราะห์ของความสว่างของ foci γH2AX โดยสแกนเลเซอร์เซลล์ (LSC) (5) รายละเอียดเพิ่มเติมจะรวมอยู่ใน SI วัสดุและวิธีการ มีรายละเอียดของปริมาณและช่วงเวลาของการใช้ยา วิเคราะห์ความหนาแน่นของยีน genomic สถานที่อุดมไป ด้วยแท็ก γH2AX-immunoprecipitated ลำดับที่ และวิเคราะห์คาดกระจายขนาดส่วนของดีเอ็นเอ ตามตำแหน่ง genomic ของ γH2AX ยอดชิปลำดับการเพาะเลี้ยงเซลล์ mIMCD3 เซลล์ (35) ถูกปลูกกลาง 45% ประกอบด้วยกลูโคสต่ำ DME (Invitrogen) แก้ไข Coon 45% F12 (หมายเลข F6636 ซิก), และ 10% FBS (HyClone) Osmolality ของควบคุมกลางถูก 300 – 320 mosmol/kg NaCl สูงปานกลางถูกเตรียม โดยการเพิ่ม NaCl osmolality รวมของ 500 mosmol/kg การทดลองทั้งหมดถูกทำในเซลล์ที่ผสาน ≈80% การเติบโตแบบลอการิทึม จะยกระดับพันธมิตร NaCl ควบคุมกลางถูกแทนที่ ด้วยสื่อ NaCl สูงการวิเคราะห์ดีเอ็นเอคู่สาระและสาระเดียวแบ่ง โดยการวิเคราะห์ดาวหาง ใช้ assays สองแตกต่างกัน: ดาวหางเป็นกลางวิเคราะห์แก้ไขตรวจแบ่งสองสแตรนด์และวิเคราะห์ดาวหางด่าง ซึ่งตรวจพบดีเอ็นเอ SSBs แบ่งสองสแตรนด์ และด่าง labile ไซต์ Assays ผู้ถูกดำเนินการอธิบาย (19) มีปรับเปลี่ยนเล็กน้อย ดูวัสดุ SI และวิธี และฟิก S4 สำหรับรายละเอียดชิพและก่อสร้าง Illumina ไลบรารีสำหรับลำดับ ทำชิพโดยเอนไซม์ในระบบโครมาติน IP ชุด (หมายเลข 9003 เซลล์ตามปกติเทคโนโลยี) แปลงของดีเอ็นเอชิปอุดมไปลงในไลบรารีที่เหมาะสำหรับใช้วิเคราะห์จีโนม Illumina ลำดับที่ดำเนินการ โดยใช้โพรโทคอลประกาศ (36) ดูวัสดุ SI และวิธี และฟิก S4 สำหรับโพรโทคอลชิลำดับรายละเอียดการวิเคราะห์ขั้นตอน Solexa ลำดับแท็กได้รับ และแม็ปกับจีโนมเมาส์ โดยใช้ไปป์ไลน์ Solexa วิเคราะห์อธิบาย (37) อ่านเฉพาะเก็บไว้ และแปลงเป็นแฟ้มข้อมูล extensible (เตียง) เบราว์เซอร์สำหรับการดูข้อมูลในเบราว์เซอร์จีโนม UCSC อ่าน genomic และเลขพิกัดได้สรุปใน windows 300 bpการวิเคราะห์การกระจายตัวของดีเอ็นเอโดย PFGE ดีเอ็นเอที่ฝังตัวถูกเตรียมโดยพ่อครัว Mammalian Genomic DNA ต่อชุดสินค้า (หมายเลข 170 – 3591; Agarose Bio-Rad) สั้น ๆ เซลล์ถูก rinsed ด้วย PBS ขูดเศษอาหาร resuspended 1% Agarose CleanCut จากชุดที่เข้มข้นสุดท้ายของ 12 ล้าน เซลล์/mL การระงับ agarose/เซลล์ ถูกหล่อที่ 4 ° C สำหรับ 10 นาทีในแม่พิมพ์ หล่อตามคณะทันตแพทยศาสตร์ของปลั๊ก agarose ในโซลูชัน Proteinase K ที่ 50 ° C สำหรับ 3 มิติย่อยโปรตีน PFGE ทำอธิบายไว้ (28) โดยใช้ระบบ DR เชฟ II (ไบ-Rad) และพารามิเตอร์ต่อไปนี้: 1% Megabase Agarose (หมายเลข 161 – 3108 Bio-Rad), 0.5 × TBE บัฟเฟอร์ทำงาน มุม 120 ° reorientation, 6 V⋅cm−1 และ 14 องศาเซลเซียส เจถูกเรียกใช้สำหรับ 16 h ด้วยเวลาการสวิตช์ของ 16 s ตาม ด้วยวิ่ง 30 h ด้วยเวลาการสวิตช์ของ 80 s ขนาดดีเอ็นเอเครื่องหมายมีดังนี้: Schizosaccharomyes pombe, Saccharomyces cerevisiae และ Hansenula chromosomes wingei (ไบโอ-Rad) เจมีสีกับ SYBR ทอง (Invitrogen)

Results (Thai) 2:

วิธีการที่ได้รับการตีพิมพ์ดวงตะวัน (1), การเปิดรับของเซลล์รังสียูวี (5), การรักษาด้วย H2O2 (20) การวิเคราะห์ของเซลล์ในเซลล์ (6), immunostaining และการวิเคราะห์ของความสว่างของจุดคงγH2AXโดย cytometry เลเซอร์สแกน (LSC) (5) รายละเอียดเพิ่มเติมจะรวมอยู่ใน SI วัสดุและวิธีการเช่นเดียวกับรายละเอียดของปริมาณและระยะเวลาของการประยุกต์ใช้ยาเสพติด, การวิเคราะห์ความหนาแน่นของยีนในสถานที่จีโนมที่อุดมไปด้วยแท็กลำดับγH2AX-immunoprecipitated และการวิเคราะห์การกระจายที่คาดหวังของชิ้นดีเอ็นเอขนาดขึ้นอยู่กับสถานที่จีโนม ของยอดเขาγH2AXชิป-Seq. การเพาะเลี้ยงเซลล์ เซลล์ mIMCD3 (35) มีการเติบโตในระดับปานกลางมี 45% DME ต่ำกลูโคส (Invitrogen) 45% F12 คูนของการปรับเปลี่ยน (ฉบับที่ F6636; Sigma) และ 10% FBS (HyClone) osmolality ของกลางควบคุมเป็น 300-320 mosmol / กก. กลางโซเดียมคลอไรด์สูงได้รับการจัดทำขึ้นโดยการเพิ่มโซเดียมคลอไรด์เพื่อ osmolality รวม 500 mosmol / กก. ทั้งหมดของการทดลองดำเนินการในลอการิทึมเซลล์เติบโตที่≈80% บรรจบกัน เพื่อยกระดับโซเดียมคลอไรด์กลางควบคุมก็ถูกแทนที่ด้วยสื่อโซเดียมคลอไรด์สูง. การวิเคราะห์ดับเบิล Strand และดีเอ็นเอ Single-Strand แบ่งโดยวิธีโคเมท สองการวิเคราะห์ที่แตกต่างกันถูกนำมาใช้: ทดสอบดาวหางเป็นกลางแก้ไขสำหรับการตรวจสอบของการแบ่งสองกลุ่มสาระและทดสอบดาวหางด่างซึ่งตรวจพบดีเอ็นเอ SSBs แบ่งสองกลุ่มสาระและเว็บไซต์ด่าง labile การตรวจผู้ที่ได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ (19) ที่มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย ดู SI วัสดุและวิธีการและรูป S4 สำหรับรายละเอียด. ชิปและ Illumina ก่อสร้างห้องสมุดลำดับ ชิปถูกดำเนินการโดยใช้ชุดเอนไซม์ Chromatin ไอพี (ฉบับที่ 9003; เซลล์ส่งสัญญาณเทคโนโลยี) แปลงของชิปที่อุดมด้วยดีเอ็นเอเป็นห้องสมุดที่เหมาะสมสำหรับการใช้ลำดับจีโนม Illumina วิเคราะห์ได้ดำเนินการโดยใช้โปรโตคอลตีพิมพ์ (36) ดู SI วัสดุและวิธีการและรูป S4 สำหรับรายละเอียดโปรโตคอลชิป-Seq. Solexa วิเคราะห์ทางท่อ แท็กลำดับที่ได้รับและแมปกับจีโนมหนูโดยใช้การวิเคราะห์ทางท่อ Solexa ตามที่อธิบายไว้ (37) ที่ไม่ซ้ำกันอ่านถูกเก็บไว้และเปลี่ยนข้อมูลเบราว์เซอร์ขยาย (เตียง) ไฟล์สำหรับการดูข้อมูลในเบราว์เซอร์จีโนม UCSC จำนวนการอ่านและพิกัดจีโนมที่ถูกสรุปไว้ในหน้าต่าง 300 bp. การวิเคราะห์การกระจายตัวของดีเอ็นเอโดย PFGE ดีเอ็นเอฝัง Agarose ถูกจัดทำขึ้นโดยใช้ CHEF Mammalian จีโนมดีเอ็นเอเสียบชุด (ฉบับที่ 170-3591; Bio-Rad) สั้น ๆ เซลล์ถูกล้างด้วยพีบีเอสหลุดออกจาน resuspended ใน 1% CleanCut Agarose จากชุดที่มีความเข้มข้นสุดท้ายของ 12 ล้านเซลล์ / มิลลิลิตร agarose / เซลล์แขวนลอยถูกผลึกที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาทีในการหล่อแม่พิมพ์ตามด้วยการบ่มปลั๊ก agarose ในการแก้ปัญหา Proteinase K ที่ 50 ° C เป็นเวลา 3 วันในการย่อยโปรตีน PFGE ได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ (28) โดยใช้ระบบ CHEF-DR II (Bio-Rad) และพารามิเตอร์ต่อไปนี้: 1% Megabase Agarose (ฉบับที่ 161-3108; Bio-Rad) 0.5 × TBE ทำงานบัฟเฟอร์ 120 ° มุม reorientation 6 V⋅cm-1, และ 14 ° C เจลวิ่งเป็นเวลา 16 ชั่วโมงด้วยเวลาสวิทช์ 16 วินาที, ตามด้วยการวิ่ง 30 ชั่วโมงด้วยเวลาสวิทช์ 80 ดีเอ็นเอขนาด Markers มีดังนี้ Schizosaccharomyes pombe, Saccharomyces cerevisiae และโครโมโซม Hansenula wingei (Bio-Rad) เจลถูกย้อมด้วย SYBR ทอง (Invitrogen)

Results (Thai) 3:

วิธีการเผยแพร่สำหรับ Western blot ( 1 ) รับเซลล์รังสี UV ( 5 ) , การรักษาด้วยแบตเตอรี่ ( 20 ) , การวิเคราะห์เซลล์แบบไมโทซีส ( 6 ) , immunostaining และการวิเคราะห์ของความสว่างของγ h2ax บันทึกโดยเลเซอร์สแกน ( ( LSC ) ( 5 ) รายละเอียดเพิ่มเติมจะรวมอยู่ในวัสดุศรีและวิธีการเช่นเดียวกับรายละเอียดของขนาดและเวลาของยาประยุกต์การวิเคราะห์ยีนในจีโนมของสถานที่ที่อุดมไปด้วยγ h2ax immunoprecipitated ลำดับแท็กและการวิเคราะห์การกระจายขนาดของชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่คาดหวังจากจีโนมที่ตั้งของγ h2ax ชิป seq ยอด

เซลล์วัฒนธรรม mimcd3 เซลล์ ( 35 ) เติบโตในอาหารที่มีกลูโคส 45% จ่ายต่ำ ( Invitrogen ) , การปรับเปลี่ยน 45% F12 คูน ( ไม่ f6636 ; Sigma ) และ 10% FBS ( hyclone )โมลาลิตี้กลางควบคุม คือ 300 และ 320 mosmol กิโลกรัม ( NaCl สูงเตรียมโดยการเพิ่มเกลือค่ารวม 500 mosmol กิโลกรัม ทั้งหมดของการทดลองจำนวน logarithmically เติบโตเซลล์ที่≈ 80% บรรจบกัน เพิ่มเกลือ , สื่อการควบคุมที่ถูกแทนที่ด้วยสื่อ NaCl สูง เส้นคู่และแบ่ง
การวิเคราะห์ดีเอ็นเอเส้นเดียวโดยดาวหาง ตามลำดับสองวิธีที่แตกต่างกันที่ใช้ : เป็นกลางดาวหางวิเคราะห์แก้ไขสำหรับการแบ่งเส้นคู่ และด่างดาวหางวิเคราะห์ซึ่งตรวจพบดีเอ็นเอ ssbs เกลียวแบ่งคู่ และเว็บไซต์ที่ด่าง วิธีที่แสดงไว้ ( 19 ) มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย ดูซี วัสดุและวิธีการ และมะเดื่อ S4 รายละเอียด .
ชิปและการก่อสร้างห้องสมุด Illumina สำหรับของชิปแสดงโดยใช้เอนไซม์พบ IP ชุด ( ไม่ 9003 ; สัญญาณมือถือเทคโนโลยี ) การแปลงของชิปอุดมดีเอ็นเอเป็นห้องสมุดเหมาะสำหรับใช้วิเคราะห์จีโนม Illumina ลำดับการตีพิมพ์โดยใช้โปรโตคอล ( 36 ) ดูวัสดุศรีและวิธีการและรูปรายละเอียดชิป S4 สำหรับ seq โปรโตคอลการวิเคราะห์ท่อ
solexa .ลำดับแท็กที่ได้รับและแมปไปยังจีโนมเมาส์ โดยใช้การวิเคราะห์ solexa ท่อตามที่อธิบายไว้ ( 37 ) าถูกเก็บไว้อ่านและแปลงข้อมูล Extensible ( เตียง ) ไฟล์สำหรับการดูข้อมูลใน ucsc จีโนมเบราว์เซอร์ การอ่านจำนวนและพิกัดจีโนมสรุปได้ใน 300 BP Windows การวิเคราะห์ DNA fragmentation โดย PFGE
.ดีเอ็นเอ , ฝังตัวเตรียมโดยพ่อครัวสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมดีเอ็นเอเสียบชุด ( ฉบับที่ 170 – 3591 ; ไบโอ ราด ) สั้น ๆ เซลล์ก็ล้างด้วย pbs ขูดออก , จาน , resuspended 1% cleancut ( จากชุดที่ความเข้มข้นสุดท้าย 12 ล้านเซลล์ / มิลลิลิตร ) ( / เซลล์แขวนลอยคือก้อนที่ 4 ° C เป็นเวลา 10 นาทีในการหล่อแม่พิมพ์ตามด้วยการบ่มเพาะของโรสปลั๊กในสารละลายโปร 50 ° C K 3 D เพื่อย่อยโปรตีน PFGE ทำการอธิบาย ( 28 ) โดยใช้ระบบ chef-dr II ( ไบโอ ราด ) และพารามิเตอร์ต่อไปนี้ : 1 % megabase โรส ( ฉบับที่ 161 ( 3108 ; ไบโอ ราด ) , 0.5 ×ทีบีวิ่งบัฟเฟอร์ 120 ° reorientation มุม 6 V ⋅ cm − 1 และ 14 องศา วิ่ง 16 เจลคือ H กับสลับเวลา 16 วินาทีตามด้วย 30-h วิ่งด้วยเวลาเปลี่ยน 80 เป็นเครื่องหมายดีเอ็นเอมีขนาดดังนี้ schizosaccharomyes pombe Saccharomyces cerevisiae และแฮนเซนูลา wingei โครโมโซม ( ไบโอ ราด ) เจลใช้ย้อม SYBR ทอง ( Invitrogen )