High NaCl Induces Double-Strand Bre

High NaCl Induces Double-Strand Breaks That Are Rapidly Repaired When the NaCl Is Lowered. We added 100 mM NaCl (which elevates the osmolality to ≈500 mosmol/kg) for 22 h to the medium bathing mIMCD3 cells. This addition of NaCl causes immediate G2/M arrest that lasts ≈6 h (6). Then, the cells begin proliferating again. By 22 h, the cell cycle distribution, appearance of the cells, and their rate of proliferation return to the condition before salt was elevated (ref. 1 and Fig. S2).
It has remained an open question what kind of DNA breaks are present in cells exposed to high NaCl. The breaks induced immediately by acute elevation of high NaCl for 1 h were originally characterized as double-strand DNA breaks (DSBs) by pulsed field gel electrophoresis (PFGE), which detects DSBs but not single-strand breaks (SSBs) (2). However, the methods used to study DNA breaks after cells adapt to high NaCl and resume proliferation were not specific to DSBs. Those methods included a version of the neutral comet assay originally developed by Ostling and Johanson (15), alkaline comet assay (1), and in vitro labeling of their 3′-OH ends with biotinylated deoxynucleotides in a reaction catalyzed by terminal deoxynucleotidyl transferase (1, 3, 4). All these methods do not distinguish between DSBs and SSBs (16–18). In the present studies, to clarify whether DNA breaks that remain induced by high NaCl in adapted cells include DSBs, we used a modification of the neutral comet assay that is specific for DSBs as opposed to SSBs (18, 19).

To confirm specificity of the neutral comet assay (19) that we used here for DSBs, we exposed cells to hydrogen peroxide (H2O2), known to induce only single-strand breaks (20). DNA breaks after H2O2 are not detected by the modified neutral comet assay but are detected by the alkaline comet assay, consistent with their single-stranded nature (Fig. 1A). We also tested mIMCD3 cells exposed to the topoisomerase inhibitor Etoposide, known to induce both double-strand and single-strand breaks in a proportion similar to ionizing radiation (20). The DNA breaks induced by Etoposide are detected by both the modified neutral and alkaline comet assay, consistent with presence of both double- and single-strand breaks (Fig. 1A). The breaks induced by high NaCl are detected by the modified neutral comet assay (Fig. 1A), indicating that they are double-stranded. The DSBs induced by high NaCl are repaired within several hours after the NaCl concentration is reduced to a total osmolality of 300 mosmol/kg (Fig. 1 B and C). Thus, an increased level of DSBs persists after cells have adapted to high NaCl and appear otherwise normal. In addition, there may also be more SSBs, but the effect of high NaCl on SSBs has not been specifically tested.

Results (Thai) 1:

NaCl สูงก่อให้เกิดการแบ่งสองสแตรนด์ที่จะซ่อมแซมอย่างรวดเร็วเมื่อ NaCl จะลดลง เราเพิ่ม 100 มม. NaCl (ซึ่งยกระดับ osmolality ในการ ≈500 mosmol/kg) สำหรับ 22 h ปานกลางอาบน้ำเซลล์ mIMCD3 นอกจากนี้ของ NaCl ทำจับ G2/M ทันทีที่เวลา ≈6 h (6) แล้ว เซลล์เริ่ม proliferating อีก โดย h 22 แจกวงจรเซลล์ ลักษณะของเซลล์ และอัตราการขยายตัวกลับสู่สภาพก่อนเกลือถูกยกระดับ (อ้างอิง 1 และฟิก S2)ยังคงเป็นคำถามเปิดที่แบ่งดีเอ็นเอชนิดใดอยู่ในเซลล์ที่สัมผัสกับ NaCl สูง ตัวแบ่งที่เกิดทันที โดยระดับเฉียบพลันของ NaCl สูงสำหรับ 1 h เดิมมีลักษณะเป็นสาระคู่ดีเอ็นเอแบ่ง (DSBs) ตามพัลเจ electrophoresis (PFGE), ซึ่งตรวจพบ DSBs แต่สาระเดียวไม่แบ่ง (SSBs) (2) อย่างไรก็ตาม วิธีการที่ใช้ในการศึกษาแบ่งดีเอ็นเอหลังจากที่เซลล์คล้อย NaCl สูง และกลับมาขยายตัวได้ไม่เฉพาะ DSBs วิธีการที่รวมรุ่นของดาวหางเป็นกลางวิเคราะห์เดิม พัฒนาโดย Ostling Johanson (15), วิเคราะห์ดาวหางด่าง (1), และการติดฉลากการเพาะเลี้ยงของปลายของ 3′ OH กับ deoxynucleotides biotinylated ในปฏิกิริยาเป็นกระบวน โดยเทอร์มินัล deoxynucleotidyl transferase (1, 3, 4) วิธีการเหล่านี้ทั้งหมดไม่แยกความแตกต่างระหว่าง DSBs และ SSBs (16-18) ในการศึกษาปัจจุบัน การชี้แจงว่าแบ่งดีเอ็นเอที่อยู่อาจ โดย NaCl สูงในเซลล์ปรับรวม DSBs เราใช้การปรับเปลี่ยนการทดสอบเป็นกลางดาวหางที่จะเฉพาะเจาะจงสำหรับ DSBs จำกัด SSBs (18, 19)ยืนยัน specificity วิเคราะห์ดาวหางกลาง (19) ที่เราใช้สำหรับ DSBs เราสัมผัสเซลล์ไฮโดรเจนเพอร์ออกไซด์ (H2O2), รู้จักกันเพื่อก่อให้เกิดการแบ่งสาระเดียวเท่านั้น (20) แบ่งดีเอ็นเอหลังจาก H2O2 จะตรวจไม่พบ โดยวิเคราะห์ดาวหางกลางแก้ไข แต่ตรวจพบ โดยวิเคราะห์ดาวหางด่าง สอดคล้องกับธรรมชาติของพวกเขาขนเดี่ยว (Fig. 1A) นอกจากนี้เรายังทดสอบ mIMCD3 เซลล์สัมผัสกับผล topoisomerase Etoposide รู้จักชวนคู่สาระ และ สาระเดียวแบ่งในสัดส่วนที่คล้ายคลึงกับรังสี ionizing (20) พบการแบ่งดีเอ็นเอที่เกิดจาก Etoposide โดยทั้งนี้ดาวหางที่เป็นกลาง และด่างแก้ไขวิเคราะห์ สอดคล้องกับสถานะของตัวแบ่งทั้งสอง - และเดี่ยวสแตรนด์ (Fig. 1A) ตัวแบ่งที่เหนี่ยวนำ โดย NaCl สูงตรวจพบ โดยวิเคราะห์ดาวหางกลางแก้ไข (Fig. 1A), ระบุว่า พวกเขาจะขนคู่ DSBs เกิดจาก NaCl สูงจะได้รับการซ่อมแซมภายในเวลาหลายชั่วโมงหลังจากที่ความเข้มข้นของ NaCl จะลดลงเป็น osmolality รวมของ 300 mosmol/kg (Fig. 1 B และ C) ดังนั้น ระดับการเพิ่มขึ้นของ DSBs ยังคงอยู่หลังจากเซลล์ได้ปรับ NaCl สูง และปรากฏอย่างอื่นปกติ นอกจากนี้ อาจยังมี SSBs เพิ่มเติม แต่ผลของ NaCl สูง SSBs ไม่ได้โดยเฉพาะทดสอบ

Results (Thai) 2:

โซเดียมคลอไรด์สูงเจือจางพักดับเบิล Strand ที่มีการซ่อมแซมอย่างรวดเร็วเมื่อโซเดียมคลอไรด์ที่ลดลงเป็น เราได้เพิ่ม 100 มิลลิโซเดียมคลอไรด์ (ซึ่งยกระดับความเข้มข้นในการ≈500 mosmol / kg) สำหรับ 22 ชั่วโมงในการอาบน้ำกลางเซลล์ mIMCD3 นอกเหนือจากโซเดียมคลอไรด์นี้ทำให้ทันที G2 / M จับกุมที่กินเวลา≈6ชั่วโมง (6) จากนั้นเซลล์จะเริ่มต้นอีกครั้ง proliferating 22 ชั่วโมงเซลล์กระจายรอบการปรากฏตัวของเซลล์และอัตราการงอกกลับไปยังสภาพก่อนที่จะได้รับการยกระดับเกลือ (Ref. 1 และรูป. S2).
มันยังคงเป็นคำถามเปิดสิ่งที่ชนิดของการแบ่งดีเอ็นเอที่มีอยู่ ในเซลล์ที่สัมผัสกับโซเดียมคลอไรด์สูง แบ่งชักนำทันทีโดยสูงเฉียบพลันของโซเดียมคลอไรด์สูงเป็นเวลา 1 ชั่วโมงมีลักษณะเดิมเป็นตัวแบ่งดีเอ็นเอดับเบิลสาระ (DSBs) โดยข่าวคราวข้อมูลชีพจร (PFGE) ซึ่งตรวจพบ DSBs แต่ไม่หยุดพักเดียวสาระ (SSBs) (2) แต่วิธีการที่ใช้ในการศึกษาแบ่งเซลล์ดีเอ็นเอหลังจากที่ปรับให้เข้ากับโซเดียมคลอไรด์สูงและดำเนินการงอกไม่ได้เฉพาะเจาะจงในการ DSBs วิธีการเหล่านั้นรวมถึงรุ่นของการทดสอบดาวหางเป็นกลางสร้างสรรค์พัฒนา Ostling และล่า (15), การทดสอบดาวหางอัลคาไลน์ (1) และในการติดฉลากหลอดทดลอง 3'-OH ของพวกเขาจบลงด้วย deoxynucleotides biotinylated ในปฏิกิริยาเร่งปฏิกิริยาด้วยขั้ว deoxynucleotidyl transferase ( 1, 3, 4) วิธีการทั้งหมดเหล่านี้จะไม่เห็นความแตกต่างระหว่าง DSBs และ SSBs (16-18) ในการศึกษาปัจจุบันที่จะชี้แจงว่าแบ่งดีเอ็นเอที่ยังคงอยู่ในระดับสูงที่เกิดจากโซเดียมคลอไรด์ในเซลล์ดัดแปลงรวมถึง DSBs เราใช้ทดสอบการเปลี่ยนแปลงของดาวหางที่เป็นกลางที่เป็นที่เฉพาะเจาะจงสำหรับ DSBs เมื่อเทียบกับ SSBs (18, 19). เพื่อยืนยันความจำเพาะของ การทดสอบดาวหางที่เป็นกลาง (19) ที่เราใช้ที่นี่เพื่อ DSBs เราสัมผัสเซลล์ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ (H2O2) หรือที่รู้จักกันเพื่อก่อให้เกิดการหยุดพักเดียวสาระเท่านั้น (20) แบ่งดีเอ็นเอหลังจาก H2O2 ยังไม่ได้ตรวจพบโดยการทดสอบดาวหางเป็นกลางแก้ไข แต่จะมีการตรวจพบโดยการทดสอบดาวหางด่างสอดคล้องกับลักษณะเดียวควั่นของพวกเขา (รูป. 1A) นอกจากนี้เรายังได้รับการทดสอบเซลล์ mIMCD3 สัมผัสกับ topoisomerase ยับยั้ง Etoposide ที่รู้จักกันเพื่อก่อให้เกิดการหยุดพักทั้งสองสาระและสาระเดียวในสัดส่วนที่คล้ายกับรังสี (20) แบ่งดีเอ็นเอที่เกิดจาก Etoposide มีการตรวจพบโดยการทดสอบดาวหางที่เป็นกลางและด่างปรับเปลี่ยนให้สอดคล้องกับการปรากฏตัวของทั้งสองแบ่งสองครั้งและสาระเดียว (รูป. 1A) แบ่งที่เกิดจากโซเดียมคลอไรด์สูงจะถูกตรวจพบโดยการทดสอบดาวหางเป็นกลางแก้ไข (รูป. 1A) แสดงให้เห็นว่าพวกเขาเป็นเกลียวคู่ DSBs ที่เกิดจากโซเดียมคลอไรด์สูงมีการซ่อมแซมภายในไม่กี่ชั่วโมงหลังจากที่ความเข้มข้นของโซเดียมคลอไรด์จะลดลงไป osmolality รวม 300 mosmol / กก. (รูปที่. 1 B และ C) ดังนั้นระดับที่เพิ่มขึ้นของ DSBs คงอยู่หลังจากที่เซลล์มีการปรับให้เข้ากับโซเดียมคลอไรด์สูงและปรากฏปกติอย่างอื่น นอกจากนี้อาจมี SSBs มากขึ้น แต่ผลของโซเดียมคลอไรด์สูงใน SSBs ยังไม่ได้รับการทดสอบโดยเฉพาะ

Results (Thai) 3:

เกลือสูง ทำให้เกลียวแบ่งคู่ที่อย่างรวดเร็วซ่อมแซมเมื่อพีเอชลดลง เราได้เพิ่ม 100 mM NaCl ( ซึ่งช่วยให้≈ 500 ค่า mosmol / กิโลกรัม ) สำหรับ 22 ชั่วโมงเพื่ออาบน้ำ mimcd3 กลางเซลล์ นอกจากนี้เกลือสาเหตุทันที G2 / M จับที่กินเวลา≈ 6 H ( 6 ) แล้วเซลล์เริ่มต้น proliferating อีกครั้ง โดย 22 ชั่วโมง การปรากฏตัวของวัฎจักรเซลล์ , เซลล์และอัตราการกลับไปสู่สภาพก่อนเกลือสูง ( อ้างอิงที่ 1 และรูปที่ S2 ) .
มันยังคงเปิดคำถามชนิดดีเอ็นเอแตกเป็นปัจจุบันในเซลล์ที่มีเกลือสูง แบ่งการทันที โดยระดับความสูงเฉียบพลันของ NaCl สูงเป็นเวลา 1 ชั่วโมง เดิมทีมีลักษณะเป็นเส้นคู่ดีเอ็นเอแตก ( dsbs ) โดยวิธีพัลซิ่งเจลฟิลด์ ( PFGE )ซึ่งตรวจพบ dsbs แต่ไม่ใช่เส้นเดียวแบ่ง ( ssbs ) ( 2 ) อย่างไรก็ตาม วิธีการที่ใช้ศึกษาดีเอ็นเอแตกหลังจากเซลล์เข้ากับเกลือสูง และมีประวัติมากไม่เฉพาะ dsbs . วิธีการเหล่านั้นรวมถึงรุ่นของดาวหางที่เป็นกลางต่อการพัฒนาเดิมโดย Ostling และ โจ นสัน ( 15 ) , ด่างดาวหางวิเคราะห์ ( 1 )และในหลอดทดลองของพวกเขาได้รับการติดฉลาก 3 - โอ้ จบด้วย ไล deoxynucleotides ในปฏิกิริยาที่เร่งโดยของเทอร์มินัล deoxynucleotidyl ( 1 , 3 , 4 ) วิธีเหล่านี้ไม่แยกแยะระหว่าง dsbs และ ssbs ( 16 – 18 ) ในการศึกษาปัจจุบัน ชี้แจงว่าเกิดจากดีเอ็นเอแตกที่ยังคงสูงในเซลล์ ได้แก่ dsbs ปรับขนาด ,ที่เราใช้ในการปรับเปลี่ยนของเป็นกลางดาวหางวิเคราะห์ที่เฉพาะเจาะจงสำหรับ dsbs เป็นนอกคอก ssbs ( 18 , 19 ) .

เพื่อยืนยัน ( ดาวหางเป็นกลางความจำเพาะ ( 19 ) ที่เราใช้ที่นี่ dsbs เราสัมผัสเซลล์ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ ( H2O2 ) ที่รู้จักกันเพื่อก่อให้เกิดเพียงเส้นเดียว ( 20 ) แบ่ง .ดีเอ็นเอแตกหลังจาก H2O2 จะตรวจไม่พบโดยการเป็นกลางดาวหางวิเคราะห์ แต่ตรวจพบโดยการทดสอบดาวหางด่าง ที่สอดคล้องกับธรรมชาติของพวกเขาเดียวติด ( รูปที่ 1A ) นอกจากนี้เรายังทดสอบ mimcd3 เซลล์สัมผัสกับประสิทธิภาพยับยั้งการนำ , ที่รู้จักกันเพื่อก่อให้เกิดทั้งเส้นคู่และแบ่งเส้นเดียวในสัดส่วนใกล้เคียงกับรังสี ( 20 )ดีเอ็นเอแตกที่เกิดจากการนำตรวจพบโดยทั้งการแก้ไขความเป็นกลางและด่างดาวหางวิเคราะห์ให้สอดคล้องกับสถานะของเส้นทั้งสองคู่และเดียวแบ่ง ( รูปที่ 1A ) การแบ่งและ NaCl สูง ตรวจพบโดยการเป็นกลางดาวหางวิเคราะห์ ( รูปที่ 1A ) แสดงว่าพวกเขาสองครั้งติดการ dsbs ที่เกิดจากโซเดียมคลอไรด์สูงซ่อมแซมภายในเวลาหลายชั่วโมงหลังจากที่ความเข้มข้นของเกลือลดลงเหลือเพียงค่าออสโมลาลิตี้รวม 300 mosmol / kg ( รูปที่ 1 B และ C ) ดังนั้น ระดับที่เพิ่มขึ้นของ dsbs ยังคงอยู่หลังจากเซลล์ได้ปรับความเค็มสูง และปรากฏเป็นอย่างอื่นปกติ นอกจากนี้ ยังอาจจะ ssbs มากขึ้น แต่ผลกระทบของเกลือโซเดียมคลอไรด์สูงใน ssbs ไม่ได้โดยเฉพาะการทดสอบ