2.5. Protein identification Protein

2.5. Protein identification
Proteins were either identified after SDSPAGEby in-gel or by on-tissue (“on polymer”) digestion. For the first,gel bands were excised with a clean scalpel and destained using 100 mM 〖Na〗_2 S_2 O_3 and 30 mM K_4Fe〖(CN)〗_6•3H_2O (1:1,v/v).Gel pieces were treated with ACN and rehydrated with 100 mM 〖NH〗_4 〖HCO〗_3. After reduction (10mM DTT in 100 mM 〖NH〗_4 〖HCO〗_3) and alkylation (50 mM iodoacetamide in 100 mM 〖NH〗_4 〖HCO〗_3) the gel pieces were dried in a vacuum centrifuge and rehydrated in approx.10 µL 50 mM 〖NH〗_4 〖HCO〗_3 (pH 8.5) containing 5% ACN and 125 ngtrypsin (porcine,proteomics grade,Roche,Switzerland). Digestion was carried out for 24 hat 37 ◦C. Peptides were extracted with 50 mM 〖NH〗_4 〖HCO〗_3/CAN (1/1,v/v) and two times with uH2O/CAN containing 0.1% TFA (1/1,v/v), for 15 min each. All extracts of one respective spot were pooled and dried in a vacuum centrifuge.After reconstitution in 0.1% TFA peptides were desalted using C_18 ZipTips (Millipore,USA) and eluted with 5 mg/mL HCCA prepared in ACN/0.1% TFA(50/50,v/v) in the final step.Peptide mass fingerprinting(PMF) and sequence tag analysis were carried out on a MALDI-TOF/RTOF instrument (UltrafleXtreme). For“onpolymer”enzymatic treatment,the ChIP-1000 was used for precise trypsin deposition at a standard concentration of 3ng/ µm^2 containing 1% Rapigest (Waters,USA) dissolved in 50 mM 〖NH〗_4 〖HCO〗_3 (pH 7.5) containing 5% ACN.Trypsin solution was applied at a lateral resolution of 100 µm covering the complete sample area.For digestion samples were stored at 37 ◦C for 24 h in saturated atmosphere (ethanol/water,50/50,v/v, 80% relative humidity).After incubation samples were carefully washed with uH2O to remove salts,delocalized peptides not adsorbed to thepolymer and autolytic fragments from trypsin.Samples were vacuum dried for 15min and HCCA was applied afterwards as described. For all enzymatic digestion data,autolytic tryptic products, keratin and blank artifacts were assigned and removed before database search (SWISSPROT,December 2013) using Mascot with the following parameters:taxonomy Homo sapiens, monoisotopic mass values,peptide mass tolerance of ±0.3 Da (for PMF and PSD experiments),2 missed cleavages,afixed modification carboxyamidomethylation and methionine oxidations set as variable modification.

Results (Thai) 1:

2.5 รหัสโปรตีน Proteins were either identified after SDSPAGEby in-gel or by on-tissue (“on polymer”) digestion. For the first,gel bands were excised with a clean scalpel and destained using 100 mM 〖Na〗_2 S_2 O_3 and 30 mM K_4Fe〖(CN)〗_6•3H_2O (1:1,v/v).Gel pieces were treated with ACN and rehydrated with 100 mM 〖NH〗_4 〖HCO〗_3. After reduction (10mM DTT in 100 mM 〖NH〗_4 〖HCO〗_3) and alkylation (50 mM iodoacetamide in 100 mM 〖NH〗_4 〖HCO〗_3) the gel pieces were dried in a vacuum centrifuge and rehydrated in approx.10 µL 50 mM 〖NH〗_4 〖HCO〗_3 (pH 8.5) containing 5% ACN and 125 ngtrypsin (porcine,proteomics grade,Roche,Switzerland). Digestion was carried out for 24 hat 37 ◦C. Peptides were extracted with 50 mM 〖NH〗_4 〖HCO〗_3/CAN (1/1,v/v) and two times with uH2O/CAN containing 0.1% TFA (1/1,v/v), for 15 min each. All extracts of one respective spot were pooled and dried in a vacuum centrifuge.After reconstitution in 0.1% TFA peptides were desalted using C_18 ZipTips (Millipore,USA) and eluted with 5 mg/mL HCCA prepared in ACN/0.1% TFA(50/50,v/v) in the final step.Peptide mass fingerprinting(PMF) and sequence tag analysis were carried out on a MALDI-TOF/RTOF instrument (UltrafleXtreme). For“onpolymer”enzymatic treatment,the ChIP-1000 was used for precise trypsin deposition at a standard concentration of 3ng/ µm^2 containing 1% Rapigest (Waters,USA) dissolved in 50 mM 〖NH〗_4 〖HCO〗_3 (pH 7.5) containing 5% ACN.Trypsin solution was applied at a lateral resolution of 100 µm covering the complete sample area.For digestion samples were stored at 37 ◦C for 24 h in saturated atmosphere (ethanol/water,50/50,v/v, 80% relative humidity).After incubation samples were carefully washed with uH2O to remove salts,delocalized peptides not adsorbed to thepolymer and autolytic fragments from trypsin.Samples were vacuum dried for 15min and HCCA was applied afterwards as described. For all enzymatic digestion data,autolytic tryptic products, keratin and blank artifacts were assigned and removed before database search (SWISSPROT,December 2013) using Mascot with the following parameters:taxonomy Homo sapiens, monoisotopic mass values,peptide mass tolerance of ±0.3 Da (for PMF and PSD experiments),2 missed cleavages,afixed modification carboxyamidomethylation and methionine oxidations set as variable modification.

Results (Thai) 2:

2.5 การระบุโปรตีน
โปรตีนที่ถูกระบุอย่างใดอย่างหนึ่งหลังจาก SDSPAGEby ในเจลหรือในเนื้อเยื่อ ("ในลิเมอร์") การย่อยอาหาร สำหรับครั้งแรกของวงเจลถูกตัดด้วยมีดผ่าตัดที่สะอาดและ destained ใช้ 100 มิลลิ〖〗นา _2 S_2 O_3 และ 30 มิลลิ K_4Fe 〖 (CN) 〗 _ 6 • 3H_2O (1: 1, v / v) ชิ้น .Gel ได้รับการรักษาด้วย ACN และ rehydrated 100 มิลลิ〖 NH 〗〖 _4 HCO 〗 _3 หลังจากที่ลดลง (10 mM DTT ใน 100 มิลลิ〖 NH 〗〖 _4 HCO 〗 _3) และ alkylation (50 มิลลิ iodoacetamide ใน 100 มิลลิ〖 NH 〗〖 _4 HCO 〗 _3) ชิ้นเจลแห้งใน centrifuge สูญญากาศและคืนรูปใน approx.10 ไมโครลิตร 50 มิลลิเมตร〖 NH 〗〖 _4 HCO 〗 _3 (pH 8.5) ที่มี ACN 5% และ 125 ngtrypsin (หมูเกรดโปรตีน, โรชวิตเซอร์แลนด์) การย่อยอาหารได้รับการดำเนินการ 24 หมวก 37 ◦C เปปไทด์ที่ถูกสกัดด้วย 50 มิลลิเมตร〖 NH 〗〖 _4 HCO 〗 _3 / CAN (1/1, v / v) และสองครั้งด้วย uH2O / CAN ที่มี 0.1% TFA (1/1, v / v) เป็นเวลา 15 นาทีในแต่ละ . สารสกัดทุกจุดหนึ่งตามที่ได้รวบรวมและแห้งในปฏิสังขรณ์ centrifuge.After สูญญากาศใน 0.1% เปปไทด์ TFA ถูก desalted ใช้ C_18 ZipTips (ค, ประเทศสหรัฐอเมริกา) และชะมี 5 มิลลิกรัม / มิลลิลิตร HCCA จัดทำขึ้น ACN / 0.1% TFA (50 / 50, v / v) ในพิมพ์ลายนิ้วมือมวล step.Peptide สุดท้าย (PMF) และการวิเคราะห์แท็กลำดับได้ดำเนินการเกี่ยวกับตราสาร MALDI-TOF / RTOF (UltrafleXtreme) สำหรับ "onpolymer" การรักษาด้วยเอนไซม์, ชิป-1000 ที่ใช้สำหรับการสะสม trypsin แม่นยำที่มีความเข้มข้นของมาตรฐาน 3ng / ไมโครเมตร ^ 2 มี 1% Rapigest (น้ำ, USA) ละลายใน 50 มิลลิ〖 NH 〗〖 _4 HCO 〗 _3 (pH 7.5) ที่มีการแก้ปัญหา ACN.Trypsin 5% ถูกนำไปใช้ที่ความละเอียดข้างของ 100 ไมโครเมตรครอบคลุมตัวอย่างที่สมบูรณ์ area.For ตัวอย่างการย่อยอาหารถูกเก็บไว้ที่อุณหภูมิ 37 ◦Cเป็นเวลา 24 ชั่วโมงในบรรยากาศอิ่มตัว (เอทานอล / น้ำ, 50/50, v / วี, ความชื้นสัมพัทธ์ 80%) หลังจากที่ตัวอย่างได้รับการบ่มล้างอย่างระมัดระวังกับ uH2O เพื่อเอาเกลือ, เปปไทด์ delocalized ไม่ดูดซับเพื่อ thepolymer และเศษย่อยสลายตัวเองจากการถูก trypsin.Samples สูญญากาศแห้ง 15 นาทีและ HCCA ถูกนำมาใช้ในภายหลังตามที่อธิบายไว้ สำหรับข้อมูลการย่อยของเอนไซม์ทุกผลิตภัณฑ์ tryptic ย่อยสลายตัวเอง, เคราตินและสิ่งประดิษฐ์ว่างเปล่าที่ได้รับมอบหมายและลบออกก่อนค้นหาฐานข้อมูล (SwissProt ธันวาคม 2013) โดยใช้มิ่งขวัญกับพารามิเตอร์ต่อไปนี้: อนุกรมวิธานที่ Homo sapiens ค่ามวล monoisotopic, เปปไทด์อดทนมวลของ± 0.3 ดา ( สำหรับ PMF และการทดลอง PSD) 2 ปริพลาด carboxyamidomethylation ปรับเปลี่ยน afixed และ oxidations methionine การปรับเปลี่ยนการตั้งค่าเป็นตัวแปร

Results (Thai) 3:

2.5 โปรตีนโปรตีนที่ถูกระบุตัว
ทั้งหลัง sdspageby ในเจล หรือในเนื้อเยื่อ ( " โพลีเมอร์ " ) ย่อย ครั้งแรก , เจลรัดตัดด้วยมีดและการทำความสะอาด destained 〖 100 มม. na 〗 _2 และ s_2 o_3 〖 k_4fe 30 มม. ( CN ) 〗 _6 - 3h_2o ( 1 : 1 v / v ) และได้รับการรักษาด้วยเจลชิ้น ACN ได้ทำการ รีไฮเดรทมกับ 100 มม. 〖 NH 〗 _4 〖 HCO 〗 _3 .หลังจากการลด ( 10mm ส่วนใน 100 มม. 〖 NH 〗 _4 〖 HCO 〗 _3 ) และอัลคิเลชัน ( 50 มม. iodoacetamide 100 มม. 〖 NH 〗 _4 〖 HCO 〗 _3 ) เจลชิ้นแห้งในสุญญากาศและเครื่องได้ทำการ รีไฮเดรทมใน approx.10 µ L 50 mm 〖 NH 〗 _4 〖 HCO 〗 _3 ( pH 8.5 ) ที่ประกอบด้วย 5% ACN และ 125 ngtrypsin ( เลือดหมู โปรตีโอมิค เกรด , โรช , สวิตเซอร์แลนด์ ) การย่อยอาหารดำเนินการ 24 หมวก 37 ◦ Cสารสกัดกับ 50 มม. 〖 NH 〗 _4 〖 HCO 〗 _3 / ( 1 / 1 , v / v ) และครั้งที่สองกับ uh2o / สามารถที่ระดับ 0.1% ( 1 / 1 , v / v ) 15 นาทีในแต่ละ สารสกัดทั้งหมดของแต่ละจุดถูก pooled และแห้งในสูญญากาศเครื่อง หลังจากที่ได้เองในระดับ 0.1% เปปไทด์เป็น desalted ใช้ c_18 ziptips ( มิลลิ , USA ) และตัวอย่างที่มี 5 mg / ml hcca เตรียม ACN / 0.1 % กรดไขมัน ( 50 / 50v / v ) ในขั้นตอนสุดท้าย เปปไทด์มวลพิมพ์ลายนิ้วมือ ( PMF ) และการวิเคราะห์ลำดับแท็กถูกดำเนินการใน maldi-tof / rtof เครื่องดนตรี ( ultraflextreme ) " onpolymer " เอนไซม์ , chip-1000 ถูกใช้สำหรับการสะสมเอนไซม์ที่แม่นยำความเข้มข้นมาตรฐานของ 3ng / µ m
2 ประกอบด้วย 1 % rapigest ( น้ำ , USA ) ละลาย 50 mm 〖 NH 〗 _4 〖 HCO 〗 _3 ( pH 7.5 ) ประกอบด้วย 5 เปอร์เซ็นต์ ต.เอนไซม์ที่ใช้ในการแก้ไขความละเอียดของ 100 µเมตรครอบคลุมพื้นที่ตัวอย่างที่สมบูรณ์ สำหรับตัวอย่างย่อยที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 24 ชั่วโมง ◦อิ่มตัวบรรยากาศ ( เอทานอล / น้ำ 50 / 50 V / V , 80 % ความชื้นสัมพัทธ์ ) หลังจากตัวอย่างบ่มเป็นอย่าง uh2o ลบล้างด้วยเกลือ ถูกเคลื่อนย้ายไป thepolymer autolytic เปปไม่ดูดซับและเศษจากทริป .เครื่องดูดฝุ่นแห้งเป็นเวลา 15 นาที และจำนวน hcca ใช้หลังจากนั้น ตามที่อธิบายไว้ สำหรับเอนไซม์ย่อยอาหารข้อมูล ผลิตภัณฑ์ autolytic Keratin และสิ่งประดิษฐ์เปล่าได้รับมอบหมายและลบออกก่อนที่ค้นหาฐานข้อมูล ( swissprot ธันวาคม 2556 ) การใช้มาสคอตด้วยพารามิเตอร์ต่อไปนี้ : อนุกรมวิธาน โฮโมเซเปี้ยน ค่ามวล monoisotopic , เปปไทด์ มวล ความอดทนของ± 03 ดา ( PMF และ PSD การทดลอง ) พลาด 2 รอยร้าว afixed carboxyamidomethylation เมทไธโอนีน , แก้ไขและ oxidations ตั้งค่าการปรับเปลี่ยนตัวแปร