During Repair of High NaCl-Induced

During Repair of High NaCl-Induced DNA Breaks, γH2AX Is Mainly Located in Gene Deserts, Whereas Bleomycin and UV Induce γH2AX at Random Locations Throughout Genome. Given that high NaCl induces DSBs that persist as long as the level of NaCl stays high, it has not been clear how cells survive and function in the continued presence of those breaks, why the cell cycle does not remain arrested, how DNA transcription and replication can proceed despite the breaks, and how mutations and genomic instability are prevented. To begin answering those questions, we have determined the genomic location of the breaks. Our strategy is based on the fact that during repair of DSBs, γH2AX is induced in distinct foci (Fig. 3). γH2AX-containing foci occur at DSBs (13, 14), and the number of γ-H2AX foci approximates the number of DSBs induced (ref. 14 and reviewed in ref. 23), making foci of γH2AX consistent and quantitative markers of DSBs. Therefore, to detect locations of DSBs, we performed chromatin immunoprecipitation (ChIP) by using anti-γH2AX antibody, followed by massive parallel sequencing of isolated DNA fragments (γH2AX ChIP-Seq) (24). Given that the maximal intensity of γH2AX foci occurs 15 min after NaCl is lowered and that the intensity of the foci already decreases by 30 min (Fig. 3B), we determined the genomic locations of the γH2AX foci that are present 15 min after lowering NaCl. In addition, we performed ChIP-Seq to determine the genomic locations of the γH2AX induced by bleomycin and UV radiation. Both bleomycin and UV increase γH2AX (Fig. 2D). However, pattern of γH2AX immunostaining is different (Fig. 3A) because of the different nature of damage induced by bleomycin and UV. Thus, bleomycin induces DSBs directly (25) and produces distinct γH2AX foci (Fig. 3A), whereas, after UV radiation, DSBs arise only indirectly as a result of the action of repair or degradation of arrested replication forks (26). After UV radiation, γH2AX is increased both in foci and in more diffused staining (Fig. 3A) that might not be related to DSBs but to some other types of DNA damage (27). Thus, by γH2AX ChIP-Seq we analyzed genomic locations of γH2AX induced by bleomycin, UV, and during repair of high NaCl-induced DNA breaks. We aligned sequence reads (tags) to the mouse genome and analyzed the tag density in the University of California, Santa Cruz (UCSC) genome browser (Fig. 4 and Fig. S5).

Results (Thai) 1:

ในระหว่างการซ่อมแซมดีเอ็นเอเกิด NaCl สูงแบ่ง γH2AX ส่วนใหญ่อยู่ในยีนหวาน ขณะ Bleomycin และ UV ทำให้เกิด γH2AX ในสถานสุ่มทั่วจีโนม ระบุว่า NaCl สูงก่อให้เกิด DSBs ที่คงอยู่ตราบเท่าที่ระดับของ NaCl อยู่สูง มันไม่ได้ชัดเจนว่าเซลล์อยู่รอด และทำงานในสถานะอย่างต่อเนื่องของเหล่าแบ่ง ทำไมรอบเซลล์ไม่อยู่จับ การ transcription ของดีเอ็นเอและการจำลองแบบสามารถดำเนินการได้แม้ มีการแบ่ง และวิธีป้องกันความไม่เสถียรของ genomic และกลายพันธุ์ เริ่มต้นตอบคำถาม เราได้กำหนดตำแหน่งของตัวแบ่ง genomic กลยุทธ์ของเราขึ้นอยู่กับความจริงที่ว่า ในระหว่างการซ่อมแซมของ DSBs, γH2AX จะเกิดจากใน foci ทั้งหมด (Fig. 3) Foci ประกอบด้วย γH2AX เกิดขึ้นที่ DSBs (13, 14), และจำนวน foci γ H2AX approximates จำนวนเกิด DSBs (อ้างอิง 14 และสรุปในการอ้างอิงที่ 23), ทำ foci γH2AX อย่างสม่ำเสมอ และปริมาณเครื่องหมายของ DSBs การตรวจหาตำแหน่งที่ตั้งของ DSBs เราดำเนิน immunoprecipitation โครมาติน (ชิพ) โดยใช้แอนติบอดีป้องกัน γH2AX ตามลำดับขนานใหญ่ของชิ้นส่วนดีเอ็นเอแยก (γH2AX ชิลำดับ) (24) ที่ความเข้มสูงสุดของ γH2AX foci เกิดขึ้น 15 นาทีหลังจาก NaCl จะลดลง และความเข้มของ foci ลดแล้ว โดย 30 นาที (Fig. 3B), เรากำหนดตำแหน่ง genomic ของ foci γH2AX ที่อยู่ 15 นาทีหลังจากลด NaCl นอกจากนี้ เราสามารถทำชิลำดับเพื่อกำหนดตำแหน่งของ γH2AX ที่เกิดจากรังสียูวีและ bleomycin genomic Bleomycin และ UV เพิ่ม γH2AX (Fig. 2D) อย่างไรก็ตาม รูปแบบของ γH2AX immunostaining เป็นอื่น (Fig. 3A) เนื่องจากลักษณะต่าง ๆ ของความเสียหายที่เกิดจากรังสียูวีและ bleomycin ดังนั้น bleomycin แท้จริง DSBs โดยตรง (25) และสร้าง γH2AX หมด foci (Fig. 3A), โดย หลังรังสี DSBs เกิดขึ้นโดยทางอ้อมเท่านั้นเป็นผลของการดำเนินการซ่อมแซมหรือของจำลองแบบจับกุมส้อม (26) หลังจากรังสี γH2AX ขึ้น ใน foci ทั้งในมากขึ้นแต่การย้อมสี (Fig. 3A) ที่อาจไม่เกี่ยวข้อง กับ DSBs แต่บางชนิดอื่น ๆ ของความเสียหายของดีเอ็นเอ (27) ดังนั้น โดย γH2AX ชิลำดับ เราวิเคราะห์ตำแหน่ง genomic ของ γH2AX เกิด bleomycin, UV และใน ระหว่างการซ่อมแซมดีเอ็นเอเกิด NaCl สูงแบ่ง เราจัดลำดับอ่าน (แท็ก) การจีโนมเมาส์ และวิเคราะห์ความหนาแน่นของแท็กในมหาวิทยาลัยแคลิฟอร์เนีย ซานตาครูซ (UCSC) เบราว์เซอร์จีโนม (Fig. 4 และฟิก S5)

Results (Thai) 2:

ในระหว่างการซ่อมแซมของโซเดียมคลอไรด์สูง-Induced แบ่งดีเอ็นเอγH2AXเป็นส่วนใหญ่ตั้งอยู่ในยีนทะเลทรายขณะ Bleomycin และ UV ชักนำให้เกิดγH2AXที่สถานที่สุ่มตลอดจีโนม ระบุว่าสูงโซเดียมคลอไรด์เจือจาง DSBs ที่ยังคงมีอยู่ตราบเท่าที่ระดับของโซเดียมคลอไรด์อยู่สูงก็ยังไม่ได้รับความชัดเจนว่าเซลล์อยู่รอดและการทำงานในการแสดงตนอย่างต่อเนื่องของการแบ่งเหล่านั้นทำไมวงจรมือถือไม่ได้ยังคงจับวิธีการถอดรหัสดีเอ็นเอและการจำลองแบบ สามารถดำเนินการต่อไปแม้จะมีการหยุดพักและวิธีการกลายพันธุ์และความไม่แน่นอนจีโนมจะมีการป้องกัน เพื่อเริ่มต้นการตอบคำถามที่เราได้กำหนดสถานที่ตั้งจีโนมของการแบ่ง กลยุทธ์ของเราจะขึ้นอยู่กับความจริงที่ว่าในระหว่างการซ่อมแซมของ DSBs, γH2AXถูกเหนี่ยวนำให้เกิดในจุดคงที่ที่แตกต่างกัน (รูปที่. 3) γH2AXที่มีจุดโฟกัสที่เกิดขึ้น DSBs (13, 14) และจำนวนของจุดคงγ-H2AX ใกล้เคียงกับจำนวนของ DSBs เหนี่ยวนำ (Ref. 14 และมีการทบทวนในการอ้างอิง. 23) ทำให้จุดคงที่ของγH2AXเครื่องหมายที่สอดคล้องและเชิงปริมาณของ DSBs ดังนั้นในการตรวจสอบสถานที่ของ DSBs เราดำเนินการ immunoprecipitation โครมาติ (ชิพ) โดยใช้แอนติบอดีต่อต้านγH2AXตามลำดับขนานใหญ่ของดีเอ็นเอที่แยก (γH2AXชิปลำดับ) (24) ระบุว่าความเข้มสูงสุดของจุดคงγH2AXเกิดขึ้น 15 นาทีหลังจากโซเดียมคลอไรด์จะลดลงและความเข้มของจุดคงที่มีอยู่แล้วลดลง 30 นาที (รูป. 3B) เรากำหนดสถานที่จีโนมของ foci γH2AXที่มีอยู่ 15 นาทีหลังจากที่ลดโซเดียมคลอไรด์ . นอกจากนี้เราดำเนินการชิปลำดับเพื่อตรวจสอบสถานที่จีโนมของγH2AXเกิดจาก bleomycin และรังสียูวี ทั้ง bleomycin และการเพิ่มขึ้น UV γH2AX (รูป. 2D) อย่างไรก็ตามรูปแบบของγH2AX immunostaining จะแตกต่างกัน (รูป. 3A) เนื่องจากลักษณะที่แตกต่างกันของความเสียหายที่เกิดจากรังสียูวีและ bleomycin ดังนั้น bleomycin เจือจาง DSBs โดยตรง (25) และผลิต foci γH2AXที่แตกต่างกัน (รูป. 3A) ในขณะที่หลังจากรังสียูวี, DSBs เกิดขึ้นทางอ้อมเท่านั้นเป็นผลมาจากการดำเนินการซ่อมแซมหรือการสลายตัวของการจำลองแบบจับส้อม (26) หลังจากที่รังสียูวี, γH2AXจะเพิ่มขึ้นทั้งในและจุดคงที่ในการย้อมสีกระจายมากขึ้น (รูป. 3A) ท​​ี่อาจจะไม่เกี่ยวข้องกับการ DSBs แต่บางชนิดอื่น ๆ ของการทำลายดีเอ็นเอ (27) ดังนั้นโดยγH2AXชิป-Seq เราวิเคราะห์จีโนมของสถ​​านγH2AXเกิดจาก bleomycin, UV และในระหว่างการซ่อมแซมสูงแบ่งดีเอ็นเอโซเดียมคลอไรด์ที่เกิดขึ้น เราชิดอ่านลำดับ (แท็ก) เพื่อจีโนมของเมาส์และวิเคราะห์ความหนาแน่นของแท็กในมหาวิทยาลัยแห่งแคลิฟอร์เนียซานตาครูซ (UCSC) เบราว์เซอร์จีโนม (รูปที่. 4 และรูป. S5)

Results (Thai) 3:

ในระหว่างการซ่อมแซมดีเอ็นเอขนาดสูงและแบ่งγ h2ax เป็นส่วนใหญ่อยู่ในยีน ทะเลทราย ในขณะที่ bleomycin และ UV ทำให้เกิดγ h2ax ในสถานที่ที่สุ่มตลอดยีโนมของ ระบุว่า เกลือสูง ทำให้ dsbs ที่คงอยู่ตราบเท่าระดับเกลืออยู่สูง มันไม่ได้ชัดเจนว่าเซลล์อยู่รอดและการทำงานในที่มีอยู่อย่างต่อเนื่องของแบ่งเหล่านั้น ทำไมรอบเซลล์ไม่ยังคงจับวิธีถอดดีเอ็นเอและการสามารถดำเนินการแม้จะมีการแบ่งและวิธีการสร้างที่มีความไม่แน่นอนและมีการป้องกัน เพื่อเริ่มต้นการตอบคำถามเหล่านั้น เราได้กำหนดตำแหน่งตัดจำเพาะของตัวแบ่ง กลยุทธ์ของเราจะขึ้นอยู่กับความจริงที่ว่า ในระหว่างการซ่อมแซม dsbs γ , h2ax เป็นการชักจูง ในบันทึกที่แตกต่างกัน ( ภาพที่ 3 ) γ h2ax ที่มีบันทึกเกิดขึ้นที่ dsbs ( 13 , 14 )และหมายเลขของγ - h2ax บันทึกมีจำนวน dsbs จากอังกฤษ และสุดท้ายในอังกฤษ 14 23 ) , การบันทึกของγ h2ax สอดคล้องและปริมาณเครื่องหมายของ dsbs . ดังนั้น การตรวจหาตำแหน่งของ dsbs เราแสดงการ immunoprecipitation ( ชิป ) โดยการใช้แอนติบอดีต่อต้าน - γ h2ax ตามลำดับแบบขนานขนาดใหญ่ของชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่แยก ( γ h2ax ชิป seq ) ( 24 )ให้ความเข้มสูงสุดของγ h2ax บันทึกเกิดขึ้น 15 นาทีหลังจากที่เกลือจะลดลง และการที่ความเข้มของบันทึกแล้วลดลง 30 นาที ( รูปที่ 3B ) เรากำหนดสถานที่จีโนมของγ h2ax บันทึกที่มีอยู่ 15 นาทีหลังจากการลดเกลือ นอกจากนี้ เราปฏิบัติเพื่อกำหนดสถานที่ชิป seq จีโนมของγ h2ax ที่เกิดจาก bleomycin และรังสี UVทั้ง bleomycin และ UV เพิ่มγ h2ax ( รูปที่ 2 ) อย่างไรก็ตาม รูปแบบของγ h2ax immunostaining แตกต่างกัน ( ภาพที่ 3 ) เนื่องจากลักษณะที่แตกต่างกันของความเสียหายที่เกิดจาก bleomycin และ UV ดังนั้น bleomycin ก่อให้เกิด dsbs โดยตรง ( 25 ) และผลิตที่แตกต่างกันγ h2ax บันทึก ( ภาพที่ 3 ) ส่วน หลังจาก รังสียูวีdsbs เกิดขึ้นโดยอ้อมเท่านั้น ผลจากการกระทำของซ่อมหรือการย่อยสลายของจับส้อมซ้ำ ( 26 ) หลังการรักษาด้วยรังสี UV γ h2ax เพิ่มขึ้นทั้งในบันทึกและในมากกว่าการกระจาย ( รูปที่ 3A ) ที่อาจจะเกี่ยวข้องกับ dsbs แต่บางชนิดอื่น ๆของความเสียหายของดีเอ็นเอ ( 27 ) ดังนั้นโดยγ h2ax ชิป seq เราวิเคราะห์จีโนมที่ตั้งของγ h2ax ที่เกิดจาก bleomycin , UV ,และในระหว่างการซ่อมแซมดีเอ็นเอขนาดสูงและแบ่ง เราอยู่ลำดับอ่าน ( Tags ) จีโนมเมาส์และวิเคราะห์แท็กความหนาแน่นในมหาวิทยาลัยแห่งแคลิฟอร์เนีย ซานตาครูซ ( ucsc ) จีโนมเบราว์เซอร์ ( รูปที่ 4 และรูปที่ S5 )