done in dupli- cate, and all measur

done in dupli- cate, and all measurements for B0 values were done in quadruplicate. Validation studies. The specificity of the anti-ATV antibody was determined by evaluating its ability to bind to various compounds likely to be present with ATV in treated human subjects. The percent cross-reactivity of each compound was calculated as the ratio of ATV and the tested compound at B/B0 equal to 50%. The accuracy and precision of the assay were determined by assaying quality control samples (drug-free human plasma spiked with ATV) and clinical samplespreviouslyquantifiedbyHPLC-UVinsixreplicates.One-wayanalysisof variance(ANOVA)oftheresultswasperformed.Thelowerlimitofquantitation (LLOQ) is defined as the lowest concentration on the standard curve that can be
406 ROUCAIROL ET AL. ANTIMICROB.AGENTS CHEMOTHER.
on February 16, 2015 by guesthttp://aac.asm.org/Downloaded from
back-calculated with adequate precision and accuracy. A plasma sample spiked at the LLOQ was assayed in six replicates. In order to establish assay specificity, we evaluated the recognition of ATV metabolites or endogenous compounds by the antibodies. Thus, plasma from HIV-positive patients was fractionated by HPLC to establish if the immunore- activity corresponded to that to a single immunoreactive compound. Sixty mi- croliters of plasma from HIV-positive patients was extracted with methanol (1/4; vol/vol) and injected into a reversed-phase C18 column (Hypersil HS C18;5m; 250by4.6mm;Thermohypersil,LesUlis,France).Chromatographicelutionwas achieved at a flow rate of 1 ml/min with a linear gradient from 10% to 100% of solvent B (solvent B was acetonitrile) in 30 min (solvent A was H2O and 0.1% trifluoroaceticacid).One-milliliterfractionswerecollected,driedundervacuum, and resuspended in 1 ml of EIA buffer before the assays for ATV were per- formed. A comparison of the results obtained by this immunoassay and the HPLC-UV methodofTributetal.(25)wasmadewith23plasmasamplesfromHIV-positive patients. Cellculturesinpresenceofatazanavir.CEMCCL-19cells(ATCC,Manassas, VA)andPBMCspreparedasdescribedaboveweregrownat37°CinRPMI1640 medium supplemented with 0.2 mM sodium pyruvate, 0.2 mM glutamine, 10% heat-inactivated fetal calf serum, and antibiotics in a 5% CO2 humidified atmo- sphere. The cell density was adjusted to 1 106/ml; and 5 ml of the suspension was incubated with 0.2, 2, and 20 g/ml of atazanavir for 24 h at 37°C. Control experiments showed that these concentrations were not toxic for the cells. The cells were washed three times in ice-cold phosphate-buffered saline (PBS), cen- trifuged (2,000 g for 5 min at 4°C), and counted with a Mallassez cell before a final extraction in 1 ml of a methanol-H2O mixture (90/10; vol/vol). The samples were then centrifuged (12,000 g for 10 min), and the supernatant was dried under vacuum by using a Speed Vac apparatus. The dry residue was dissolved in 1 ml of EIA buffer and assayed for its ATV content. At each step of the washing procedure, the PBS medium was assayed for ATV content.NoATVwasdetectedafterthethirdwash,confirmingthatthreewashes with ice-cold PBS were required to remove any contaminating medium contain- ing ATV. Furthermore, all the CEM cell pellets were extracted twice, and no ATV was detected in the second extraction. Drug accumulation was assessed at 37°C. CEM cell suspensions were incu- bated for 2 h at 37°C in the absence or presence of probenecid, verapamil, or dipyridamole(50 Meach);efavirenz(EFZ;24 M);nevirapine(NVP;28 M); ritonavir (RTV; 2.3 M); or ATV (7 M, which corresponds to the mean maximum concentrations observed with boosted ATV treatment). The samples were processed by the protocols described above before ATV quantification. Intracellular concentrations were calculated by assuming cell volumes of 1 pl for each CEM and 0.4 pl for each PBMC.

RESULTS Antibody production and assay development. In order to allow a covalent link with proteins, ATV was converted into a primary amino derivative through its hydroxyl function (see Materials and Methods). This provides a useful way to couple ATV with BSA, which is an obligatory step for specific anti- body production, as well as with AchE for the preparation of a tracer. A very good antibody titer (greater than 1/100,000) was measured by EIA for the two immunized rabbits from the second booster injection onwards. Using the ATV-AChE tracer, we selected the best antiserum and optimized the dilu- tion for the assay. A typical routine calibration curve for the ATV assay with antiserum at an initial dilution of 1/500,000 is shown in Fig. 1. The LLOQ was close to 150 pg/ml (10.5 fmol/well) in EIA buffer. The precision was also very satisfac- tory, since the coefficients of variation for the standard curve from six independent experiments ranged from 1.2 to 9.3%, while the error ranged from 4 to 6% in reproducibility ex- periments (Fig. 1). There was no obvious bias, since the errors were both positive and negative. Validation studies. The specificities of the polyclonal anti- ATV antibodies were first analyzed by using antiviral agents commonly used during HIV treatment. No interference, as


DISCUSSION This paper reports on the development of a new competitive enzymeimmunoassayforATVthatallowsmeasurementsofits concentrations in biological fluids and cell extracts. The poly- clonal anti-ATV antibodies raised in rabbits are specific for ATVsincenointerferenceduetootheranti-HIVdrugs(cross- reactivities, 0.01%) or endogenous plasma or cell com- pounds was recorded. The present assay was also highly sen- sitive, with an LLOQ of 150 pg per ml, which compares favorably with those close to 50 ng/ml (5, 7, 18, 25) and above 1 ng/ml (8, 11, 21) previously reported for the LC-UV and LC-MS-MS methods, respectively. Attempts to obtain direct measurements of the concentrations in plasma were not suc- cessful probably due to the binding of the drug to plasma proteins, in particular, -1-acid glycoprotein and albumin (lev- elsofbinding,89%and86%,respectively)(Reyataz,Summary

Results (Indonesian) 1:

dilakukan di dupli-cate, dan semua pengukuran untuk B0 nilai-nilai yang dilakukan di quadruplicate. Studi validasi. Specificity anti-ATV antibodi ditentukan oleh mengevaluasi kemampuan untuk mengikat untuk berbagai macam senyawa cenderung hadir dengan ATV di diperlakukan subyek manusia. Cross-reactivity persen dari setiap senyawa dihitung sebagai rasio ATV dan senyawa diuji pada B/B0 sama dengan 50%. Akurasi dan presisi assay yang ditentukan oleh assaying, Refinery kontrol kualitas sampel (obat bebas manusia plasma berduri dengan ATV) dan oftheresultswasperformed samplespreviouslyquantifiedbyHPLC-UVinsixreplicates.One-wayanalysisof klinis varians (ANOVA).Thelowerlimitofquantitation (LLOQ) adalah defined sebagai konsentrasi terendah pada kurva standar yang dapatANTIMICROB 406 ROUCAIROL ET AL..CHEMOTHER AGEN. pada Februari 16, 2015 oleh guesthttp://aac.asm.org/Downloaded dari back-calculated with adequate precision and accuracy. A plasma sample spiked at the LLOQ was assayed in six replicates. In order to establish assay specificity, we evaluated the recognition of ATV metabolites or endogenous compounds by the antibodies. Thus, plasma from HIV-positive patients was fractionated by HPLC to establish if the immunore- activity corresponded to that to a single immunoreactive compound. Sixty mi- croliters of plasma from HIV-positive patients was extracted with methanol (1/4; vol/vol) and injected into a reversed-phase C18 column (Hypersil HS C18;5m; 250by4.6mm;Thermohypersil,LesUlis,France).Chromatographicelutionwas achieved at a flow rate of 1 ml/min with a linear gradient from 10% to 100% of solvent B (solvent B was acetonitrile) in 30 min (solvent A was H2O and 0.1% trifluoroaceticacid).One-milliliterfractionswerecollected,driedundervacuum, and resuspended in 1 ml of EIA buffer before the assays for ATV were per- formed. A comparison of the results obtained by this immunoassay and the HPLC-UV methodofTributetal.(25)wasmadewith23plasmasamplesfromHIV-positive patients. Cellculturesinpresenceofatazanavir.CEMCCL-19cells(ATCC,Manassas, VA)andPBMCspreparedasdescribedaboveweregrownat37°CinRPMI1640 medium supplemented with 0.2 mM sodium pyruvate, 0.2 mM glutamine, 10% heat-inactivated fetal calf serum, and antibiotics in a 5% CO2 humidified atmo- sphere. The cell density was adjusted to 1 106/ml; and 5 ml of the suspension was incubated with 0.2, 2, and 20 g/ml of atazanavir for 24 h at 37°C. Control experiments showed that these concentrations were not toxic for the cells. The cells were washed three times in ice-cold phosphate-buffered saline (PBS), cen- trifuged (2,000 g for 5 min at 4°C), and counted with a Mallassez cell before a final extraction in 1 ml of a methanol-H2O mixture (90/10; vol/vol). The samples were then centrifuged (12,000 g for 10 min), and the supernatant was dried under vacuum by using a Speed Vac apparatus. The dry residue was dissolved in 1 ml of EIA buffer and assayed for its ATV content. At each step of the washing procedure, the PBS medium was assayed for ATV content.NoATVwasdetectedafterthethirdwash,confirmingthatthreewashes with ice-cold PBS were required to remove any contaminating medium contain- ing ATV. Furthermore, all the CEM cell pellets were extracted twice, and no ATV was detected in the second extraction. Drug accumulation was assessed at 37°C. CEM cell suspensions were incu- bated for 2 h at 37°C in the absence or presence of probenecid, verapamil, or dipyridamole(50 Meach);efavirenz(EFZ;24 M);nevirapine(NVP;28 M); ritonavir (RTV; 2.3 M); or ATV (7 M, which corresponds to the mean maximum concentrations observed with boosted ATV treatment). The samples were processed by the protocols described above before ATV quantification. Intracellular concentrations were calculated by assuming cell volumes of 1 pl for each CEM and 0.4 pl for each PBMC.Pengembangan antibodi hasil produksi dan pengujian. Agar link kovalen dengan protein, ATV diubah menjadi turunan amino utama melalui hidroksil yang berfungsi (Lihat bahan dan metode). Ini menyediakan cara yang berguna untuk beberapa ATV dengan BSA, yang merupakan langkah wajib untuk specific anti-tubuh produksi, serta dengan sakit untuk persiapan pelacak. Titer antibodi yang sangat baik (lebih dari 1/100.000) diukur oleh EIA untuk dua kelinci immunized dari kedua booster injeksi dan seterusnya. Menggunakan perunut ATV-sakit, kita dipilih antiserum terbaik dan dioptimalkan dilu-tion untuk assay. Kurva kalibrasi rutin yang khas untuk assay ATV dengan antiserum di awal pengenceran 1 500.000 ditunjukkan dalam gambar 1. LLOQ adalah dekat dengan 150 pg/ml (10.5 fmol/well) dalam EIA buffer. Presisi adalah juga sangat satisfac-tory, sejak coefficients variasi untuk kurva standar dari enam percobaan independen yang berkisar antara 1,2-9,3%, sementara kesalahan berkisar 4-6% di reproduktibilitas ex-periments (Fig. 1). Ada bias tidak jelas, karena kesalahan positif dan negatif. Studi validasi. Specificities anti-ATV antibodi poliklonal adalah posisi yang dianalisis dengan menggunakan agen antivirus yang digunakan selama pengobatan HIV. Tidak ada gangguan, sebagaiDISKUSI karya ini laporan tentang perkembangan baru kompetitif enzymeimmunoassayforATVthatallowsmeasurementsofits konsentrasi di biologi fluids dan ekstrak sel. Poli - klonal anti-ATV antibodi dibesarkan di kelinci adalah specific untuk ATVsincenointerferenceduetootheranti-HIVdrugs(cross-reactivities, 0.01%) atau endogen plasma atau sel com-pound tercatat. Assay sekarang ini juga sangat sen-sitive, dengan LLOQ PG 150 per ml, yang membandingkan menguntungkan dengan mereka dekat dengan 50 ng/ml (5, 7, 18, 25) dan di atas 1 ng/ml (8, 11, 21) sebelumnya dilaporkan untuk LC-UV dan metode LC-MS-MS, masing-masing. Upaya untuk mendapatkan langsung pengukuran konsentrasi dalam plasma bukanlah suc-cessful mungkin karena pengikatan obat untuk protein plasma, khususnya, -1-glikoprotein asam dan albumin (lev-elsofbinding, 89% and86%, masing-masing)(Reyataz,Summary

Results (Indonesian) 2:

dilakukan di cate dupli-, dan semua pengukuran untuk nilai B0 dilakukan dalam rangkap empat. Studi validasi. Fi kota tertentu dari antibodi anti-ATV ditentukan dengan mengevaluasi kemampuannya untuk mengikat berbagai senyawa kemungkinan akan hadir dengan ATV di subyek manusia diperlakukan. The persen reaktivitas silang dari masing-masing senyawa dihitung sebagai rasio ATV dan senyawa diuji di B / B0 sebesar 50%. Akurasi dan presisi dari pengujian yang ditentukan dengan pengujian sampel kontrol kualitas (plasma manusia bebas narkoba dibubuhi ATV) dan klinis fi samplespreviouslyquanti edbyHPLC-UVinsixreplicates.One-wayanalysisof varians (ANOVA) oftheresultswasperformed.Thelowerlimitofquantitation (LLOQ) adalah didefinisikan sebagai konsentrasi terendah pada kurva standar yang dapat
406 ROUCAIROL ET AL. ANTIMICROB.AGENTS CHEMOTHER.
pada tanggal 16 Februari 2015 oleh guesthttp: //aac.asm.org/Downloaded dari
back-dihitung dengan presisi dan akurasi yang memadai. Contoh plasma berduri di LLOQ yang diuji dalam enam ulangan. Dalam rangka membangun assay spesifik kota, kami mengevaluasi pengakuan metabolit ATV atau senyawa endogen oleh antibodi. Dengan demikian, plasma dari pasien HIV-positif difraksinasi dengan HPLC untuk menentukan apakah aktivitas immunore- berhubungan dengan itu untuk senyawa immunoreactive tunggal. Enam puluh croliters mi- plasma dari pasien HIV-positif diekstraksi dengan metanol (1/4; vol / vol) dan disuntikkan ke dalam fase terbalik C18 kolom (Hypersil HS C18, 5m, 250by4.6mm, Thermohypersil, LesUlis, Prancis) .Chromatographicelutionwas dicapai pada tingkat aliran fl dari 1 ml / menit dengan gradien linier dari 10% sampai 100% dari pelarut B (pelarut B adalah asetonitril) dalam 30 menit (pelarut A adalah H2O dan 0,1% tri fl uoroaceticacid) .Salah satu-milliliterfractionswerecollected, driedundervacuum , dan diresuspensi dalam 1 ml EIA penyangga sebelum tes untuk ATV yang per- terbentuk. Perbandingan hasil yang diperoleh oleh immunoassay ini dan HPLC-UV methodofTributetal. (25) pasien wasmadewith23plasmasamplesfromHIV-positif. Cellculturesinpresenceofatazanavir.CEMCCL-19cells (ATCC, Manassas, VA) andPBMCspreparedasdescribedaboveweregrownat37 ° CinRPMI1640 medium dengan 0,2 mM natrium piruvat, 0,2 mM glutamin, 10% panas dilemahkan serum janin anak sapi, dan antibiotik dalam 5% CO2 humidi fi kasi atmo- bola. Kepadatan sel disesuaikan dengan 1 106 / ml; dan 5 ml suspensi diinkubasi dengan 0,2, 2, dan 20 g / ml atazanavir selama 24 jam pada 37 ° C. Kontrol percobaan menunjukkan bahwa konsentrasi ini tidak beracun bagi sel. Sel-sel dicuci tiga kali dalam buffer fosfat garam dingin (PBS),-pusat trifuged (2.000 g selama 5 menit pada 4 ° C), dan dihitung dengan sel Mallassez sebelum ekstraksi fi nal dalam 1 ml methanol- sebuah Campuran H2O (90/10; vol / vol). Sampel kemudian disentrifugasi (12.000 g selama 10 menit), dan supernatan dikeringkan di bawah vakum dengan menggunakan alat Kecepatan Vac. Residu kering dilarutkan dalam 1 ml EIA penyangga dan diuji untuk konten ATV-nya. Pada setiap langkah dari prosedur mencuci, media PBS diuji untuk ATV content.NoATVwasdetectedafterthethirdwash, rmingthatthreewashes con fi dengan dingin PBS diminta untuk menghilangkan mencemari contain- menengah ing ATV. Selain itu, semua pelet sel CEM diekstrak dua kali, dan tidak ada ATV terdeteksi di ekstraksi kedua. Akumulasi obat dinilai pada 37 ° C. Suspensi sel CEM yang incu- tertahan selama 2 jam pada suhu 37 ° C dengan tidak adanya atau kehadiran probenesid, verapamil, atau dipiridamol (50 Meach); efavirenz (EFZ; 24 M); nevirapine (NVP; 28 M); ritonavir (RTV; 2,3 M); atau ATV (7 M, yang sesuai dengan konsentrasi maksimum rata-rata diamati dengan meningkatkan pengobatan ATV). Sampel diolah oleh protokol yang dijelaskan di atas sebelum ATV kuantifikasi. Konsentrasi intraseluler dihitung dengan asumsi volume sel 1 pl untuk setiap CEM dan 0,4 pl untuk setiap PBMC. produksi HASIL antibodi dan pengembangan uji. Untuk memungkinkan link kovalen dengan protein, ATV diubah menjadi turunan amino primer melalui fungsi hidroksil (lihat Bahan dan Metode). Ini menyediakan cara yang berguna untuk beberapa ATV dengan BSA, yang merupakan langkah wajib untuk spesifik anti produksi tubuh, serta dengan sakit untuk persiapan sebuah pelacak. Sebuah titer antibodi yang sangat baik (lebih besar dari 1 / 100.000) diukur dengan EIA untuk dua kelinci diimunisasi dari injeksi penguat kedua dan seterusnya. Menggunakan pelacak ATV-AChE, kami memilih antiserum terbaik dan dioptimalkan tion dilu- untuk pengujian tersebut. Kurva kalibrasi rutin khas untuk uji ATV dengan antiserum pada pengenceran awal 1 / 500.000 ditunjukkan pada Gambar. 1. LLOQ ini dekat dengan 150 pg / ml (10,5 fmol / baik) di EIA penyangga. Presisi ini juga tory sangat kepuasan, karena koefisien koe fi variasi untuk kurva standar dari enam percobaan independen berkisar 1,2-9,3%, sedangkan kesalahan berkisar dari 4 sampai 6% pada reproduktifitas mantan periments (Gbr. 1). Tidak ada prasangka, karena kesalahan yang baik positif maupun negatif. Studi validasi. Kota-kota-spesifikasi dari poliklonal antibodi anti ATV yang pertama dianalisis dengan menggunakan antivirus yang umum digunakan selama pengobatan HIV. Tidak ada gangguan, seperti DISKUSI Makalah ini melaporkan pengembangan konsentrasi enzymeimmunoassayforATVthatallowsmeasurementsofits kompetitif baru dalam fluida biologis dan ekstrak sel. Poly klonal antibodi anti-ATV dibesarkan di kelinci spesifik untuk ATVsincenointerferenceduetootheranti-HIVdrugs (reaktivitas silang, 0,01%) atau endogen plasma atau sel pound com- tercatat. Uji ini juga rahasia dan sensitif sangat sitivity, dengan LLOQ dari 150 pg per ml, yang lebih baik dibandingkan dengan mereka yang dekat dengan 50 ng / ml (5, 7, 18, ​​25) dan di atas 1 ng / ml (8, 11, 21) dilaporkan sebelumnya untuk LC-UV dan LC-MS-MS metode, masing-masing. Upaya untuk mendapatkan pengukuran langsung konsentrasi dalam plasma tidak DSS ini berhasil mungkin karena pengikatan obat pada protein plasma, khususnya, -1-asam glikoprotein dan albumin (elsofbinding lev-, 89% and86%, masing-masing) ( Reyataz, Ringkasan