Microbial diversity and type of MRS

Microbial diversity and type of MRSA analysis

Microbial diversity analysis

Microbial DNA was extracted from fecal samples using the E.Z.N.A. ® DNA Kit (Omega Bio-tek, Norcross, GA, U.S.) according to manufacturer’s protocols. The V4-V5 region of the bacteria 16S ribosomal RNA gene were amplified by PCR (95 °C for 2 min, followed by 25 cycles at 95 °C for 30 s, 55 °C for 30 s, and 72 °C for 30 s and a final extension at 72 °C for 5 min) using primers 515 F 5’-barcode- GTGCCAGCMGCCGCGG)-3’ and 907R 5’-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3’, where barcode is an eight-base sequence unique to each sample. PCR reactions were performed in triplicate 20 μL mixture containing 4 μL of 5 × FastPfu Buffer, 2 μL of 2.5 mM dNTPs, 0.8 μL of each primer (5 μM), 0.4 μL of FastPfu Polymerase, and 10 ng of template DNA. Amplicons were extracted from 2 % agarose gels and purified using the AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Axygen Biosciences, Union City, CA, U.S.) according to the manufacturer’s instructions and quantified using QuantiFluor™ -ST (Promega, U.S.). Purified amplicons were pooled in equimolar and paired-end sequenced (2 × 250) on an Illumina MiSeq platform according to the standard protocols. The raw reads were deposited into the NCBI Sequence Read Archive (SRA) database.

Results (Russian) 2:

Микробное разнообразие и тип анализа МРСА

Микробный анализ разнообразия

микробных ДНК экстрагировали из образцов фекалий с использованием EZNA ® Kit ДНК (Omega Bio-Tek, Norcross, GA, США) в соответствии с протоколами производителя. В4-В5 область бактерий 16S рибосомальной гена РНК амплифицировали с помощью ПЦР (95 & deg ; С в течение 2 мин, затем 25 циклов при 95 ° С в течение 30 сек, 55 ° C в течение 30 с, и 72 ° С в течение 30 сек и окончательное удлинение при 72 ° с в течение 5 мин) с использованием праймеров 515 F 5'-barcode- GTGCCAGCMGCCGCGG) -3 'и 5'-907R CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3', где штрих - код представляет собой восемь последовательность оснований уникальной для каждого образца. ПЦР - реакции проводили в трех повторностях 20 мкл смеси , содержащей 4 мкл 5 × FastPfu буфера, 2 мкл 2,5 мМ дНТФ, 0,8 мкл каждого праймера (5 мкМ), 0,4 мкл FastPfu полимеразой и 10 нг матричной ДНК. Ампликоны были извлечены из 2% агарозном геле и очищали с использованием набора ДНК AxyPrep Gel Extraction (Axygen Biosciences, Юнион - Сити, штат Калифорния, США) в соответствии с инструкциями изготовителя и количественно , используя QuantiFluor ™ -sT (Promega, США). Очищенные ампликонов были объединены в эквимолярных и парноконцевое секвенирован (2 × 250) на платформе Illumina MiSeq в соответствии со стандартными протоколами. Необработанные чтений были сданы на хранение в базу данных NCBI Последовательность чтения Архив (SRA).

Results (Russian) 3:

микробного разнообразия и тип мрзс анализмикробного разнообразия анализмикробные днк было извлечено из фекалий, образцы с использованием e.z.n.a. ® днк материалов (омега - био - тек, norcross, га, сша), в соответствии с заводом - изготовителем протоколов.в v4-v5 региона бактерии 16S ррнк ген усугубляются пцр (95 градусов за 2 минуты, а затем 25 циклов на 95 градусов в течение 30 S, 55 градусов в течение 30 S и 72 °с в течение 30 S и окончательное продление на 72 °C за 5 мин) с использованием азбуки 515 F 5 "- - - gtgccagcmgccgcgg) - 3 "и 907r 5 - ccgtcaattcmtttragttt-3", где штрих - код - это восемь базовых последовательность уникальными для каждого образца.реакция пцр проводились в трех экземплярах 20 мкм л смеси, содержащей 4 (l 5  ×  fastpfu буфера, 2 мкм - 2,5 мм dntps, 0,8 мг л каждый Primer (5 мкм), 0,4 мг л fastpfu полимераза, и 10 нг шаблона днк.amplicons были получены от 2% агаровый гели и чистый, используя axyprep днк гель добычи Kit (axygen бионаук, юнион - сити, калифорния, сша), согласно инструкциям завода - изготовителя и его использования quantifluor "- ST (promega, сша).чистый amplicons были объединены в equimolar и парных конец последовательности (2  ×  250) на illumina miseq платформы в соответствии со стандартом протоколов.сырье гласит были сданы на хранение в ncbi последовательность читать архив (сра) базы данных.