Header image BCH4053L Biochemistry

Header image BCH4053L
Biochemistry Laboratory Manual

HOME | RELEVANCE | BACKGROUND | PROCEDURE | PRELAB



Extraction and Purification of Lysozyme from Hen Eggs - Background


Composed of various experiments performed over a span of several weeks, the initial experiments in characterizing lysozyme will be devoted to the protein’s extraction through dialysis and purification by ion-exchange chromatography.

Whether referring to dialysis in the medical or biochemical sense, both processes depend on the diffusion of solute particles. Focusing on the biochemical technique, this process is typically achieved by isolating a solution of interest inside semi-permeable dialysis tubing and then placing it in either de-ionized water or a particular buffer. Over time, small solute particles, molecules with diameters less than the pores of the tubing like H2O and NaCl, will pass across the membrane in the direction of decreasing concentration and reach equilibrium, while larger particles like DNA, proteins, and polysaccharides are retained as shown in the figure. Though this technique is unable to distinguish between macromolecules, it is particularly useful in separating large molecules from smaller ones. Furthermore, due to the ability of small solute particles to freely move in and out of the surrounding medium, dialysis can be repeated so that the original solvent may be replaced with an entirely different medium.

Dialysis I

Accompanied by an increase in entropy, the diffusion of solute particles down a concentration gradient (i.e. from a region of higher concentration to one of lower concentration) is thermodynamically favorable. Still, diffusion is a completely random process, and thus dependent upon the square of the distance a solute molecule must diffuse. For example, if on average it takes one second for a solute molecule to diffuse only one centimeter, that same particle would take 25 seconds to diffuse 5-cm. Diffusion is also affected by a solution’s viscosity as solute particles in highly viscous mediums will exhibit slower diffusion rates than the same particles in mediums with lower viscosities.

Lysozyme is a positively charged, basic protein under a reasonably neutral pH. In order to maintain this characteristic for ion-exchange chromatography, we will dialyze against a tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) buffer. An effective buffer over a pH range of ~6.5 to 9.7, Tris is the most commonly used buffer in biological research because it is the only inexpensive compound with a pKa in the slightly alkaline pH range. The majority of primary amines have pKa values greater than 9.0, but due to the strong electron withdrawing power of the three hydroxyl groups present on the methylene substitutents of Tris, the pKa of this buffer is ~8.0 at 25oC and optimal for our protein.

In a more general sense, dialyzing against a buffer is advantageous for a variety of reasons. Other than controlling both the salt concentration and pH, and therefore protecting our protein from denaturation, dialysis is often preformed against a buffer to prepare for the next step. Dialyzing against a buffer therefore not only removes the salt from our solution and prevents denaturation, but places the protein in the buffer needed for the next step in an experiment.

The last step in our extraction of lysozyme is centrifugation. During dialysis, some biological molecules (lipids, carbohydrates, etc.) will precipitate out of solution, and if these particles are not removed there is a chance they may interfere with the next step. In particular for our experiment, if the precipitates are not removed before ion-exchange there is a chance that they may clog the column and prevent the separation from working effectively. Thus, we must centrifuge our sample prior to this step in order to eliminate any potential risk.

Once the smaller solute molecules have been removed from our sample, we can then begin to separate the larger molecules by a form of ion-exchange chromatography. Ion-exchange is a separation technique utilized for nearly all kinds of charged molecules including large proteins, nucleotides, and even amino acids. The principle behind this technique is based on Coulombic interactions between the sample and the matrix. Specifically, the matrix, which is most commonly cellulose- and agarose-based resin, is coated with ionic functional groups capable of interacting with molecules exhibiting groups of opposing charges.

Overall, there are two major types of ion-exchange: (1) cation-exchange; and (2) anion-exchange. In cation-exchange, the matrix is coated with negatively charged functional groups (i.e. carboxymethyl (CM); —CH2COO-) in order to retain cations, while positively charged groups are utilized to retain anions (i.e. diethylaminoethyl (DEAE) (—CH2CH2NH(CH2CH3)2+). In this portion of the experiment we will be utilizing the cation-exchanger CM-Sephadex-25 which will effectively separate the positively charged lysozyme from molecules of negative and neutral charge.

Dialysis II
After construction of your column is complete, you will allow a specific volume of your sample to infiltrate the column bed. At this point, all of the positively charged macromolecules will interact with the stationary phase while the neutrally and negatively charged molecules will pass through. This is facilitated by washing the column with an eluant, which moves those proteins with relatively low affinity for the matrix through the column faster than those interacting with the matrix. Overall, the affinity of a specific protein for the matrix depends upon the pH of solution as well as the presence of ions capable of competing for matrix binding.

The final step in this process is to elute those proteins interacting with the matrix. Elution is generally accomplished in one of two ways (as alluded to in the previous paragraph): (1) either by changing the pH of the mobile phase; or (2) its salt concentration. Recalling that the pH of a solution can affect the overall charge of a molecule in solution, a protein that has an initial positive charge, and interacts with the matrix, can be eluted from the column by an increase in pH. The increase in pH will alter the overall charge of the macromolecule and therefore lower its affinity for the stationary phase causing it to elute from the column. One downside to a pH gradient is the difficulty in controlling it, therefore in our experiment we will utilize a linear salt gradient.

Elution by changing the salt concentration of the mobile phase, and therefore its ionic strength, is a more subtle effect. By starting with a mobile phase of minimal salt concentration, the positively charged lysozyme is preferred by the matrix. However, as the concentration of salt in our buffer is increased, the matrix will begin to decrease its affinity for the lysozyme preferring to interact with the salt. As a result, the lysozyme will begin to elute from the column so that fractions can be collected and assayed in the next series of experiments.

Results (Thai) 1:

Header image BCH4053L Biochemistry Laboratory Manual HOME | RELEVANCE | BACKGROUND | PROCEDURE | PRELAB Extraction and Purification of Lysozyme from Hen Eggs - Background Composed of various experiments performed over a span of several weeks, the initial experiments in characterizing lysozyme will be devoted to the protein’s extraction through dialysis and purification by ion-exchange chromatography.Whether referring to dialysis in the medical or biochemical sense, both processes depend on the diffusion of solute particles. Focusing on the biochemical technique, this process is typically achieved by isolating a solution of interest inside semi-permeable dialysis tubing and then placing it in either de-ionized water or a particular buffer. Over time, small solute particles, molecules with diameters less than the pores of the tubing like H2O and NaCl, will pass across the membrane in the direction of decreasing concentration and reach equilibrium, while larger particles like DNA, proteins, and polysaccharides are retained as shown in the figure. Though this technique is unable to distinguish between macromolecules, it is particularly useful in separating large molecules from smaller ones. Furthermore, due to the ability of small solute particles to freely move in and out of the surrounding medium, dialysis can be repeated so that the original solvent may be replaced with an entirely different medium.Dialysis IAccompanied by an increase in entropy, the diffusion of solute particles down a concentration gradient (i.e. from a region of higher concentration to one of lower concentration) is thermodynamically favorable. Still, diffusion is a completely random process, and thus dependent upon the square of the distance a solute molecule must diffuse. For example, if on average it takes one second for a solute molecule to diffuse only one centimeter, that same particle would take 25 seconds to diffuse 5-cm. Diffusion is also affected by a solution’s viscosity as solute particles in highly viscous mediums will exhibit slower diffusion rates than the same particles in mediums with lower viscosities.Lysozyme is a positively charged, basic protein under a reasonably neutral pH. In order to maintain this characteristic for ion-exchange chromatography, we will dialyze against a tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) buffer. An effective buffer over a pH range of ~6.5 to 9.7, Tris is the most commonly used buffer in biological research because it is the only inexpensive compound with a pKa in the slightly alkaline pH range. The majority of primary amines have pKa values greater than 9.0, but due to the strong electron withdrawing power of the three hydroxyl groups present on the methylene substitutents of Tris, the pKa of this buffer is ~8.0 at 25oC and optimal for our protein.In a more general sense, dialyzing against a buffer is advantageous for a variety of reasons. Other than controlling both the salt concentration and pH, and therefore protecting our protein from denaturation, dialysis is often preformed against a buffer to prepare for the next step. Dialyzing against a buffer therefore not only removes the salt from our solution and prevents denaturation, but places the protein in the buffer needed for the next step in an experiment.The last step in our extraction of lysozyme is centrifugation. During dialysis, some biological molecules (lipids, carbohydrates, etc.) will precipitate out of solution, and if these particles are not removed there is a chance they may interfere with the next step. In particular for our experiment, if the precipitates are not removed before ion-exchange there is a chance that they may clog the column and prevent the separation from working effectively. Thus, we must centrifuge our sample prior to this step in order to eliminate any potential risk.เมื่อโมเลกุลของตัวถูกละลายขนาดเล็กจะถูกเอาออกจากตัวอย่างของเรา จากนั้นเราจะเริ่มแยกโมเลกุลใหญ่ โดยรูปแบบของการแลกเปลี่ยนไอออน chromatography แลกเปลี่ยนไอออนเป็นเทคนิคแยกใช้สำหรับการคิดค่าธรรมเนียมโมเลกุลโปรตีนขนาดใหญ่ นิวคลีโอไทด์ และกรดอะมิโนได้เกือบทุกชนิด หลักการเบื้องหลังเทคนิคนี้ขึ้นอยู่กับ Coulombic การโต้ตอบระหว่างตัวอย่างและเมตริกซ์ โดยเฉพาะ เมตริกซ์ ซึ่งมักใช้เซลลูโลส และ agarose เรซิ่น เคลือบ ด้วย ionic functional กลุ่มความสามารถในการโต้ตอบกับโมเลกุลอย่างมีระดับกลุ่มค่าธรรมเนียมที่ฝ่ายตรงข้ามโดยรวม มีสองประเภทหลักของการแลกเปลี่ยนไอออน: cation (1) -แลก และ anion exchange (2) ใน cation exchange เมตริกซ์จะเคลือบ ด้วยกลุ่ม functional ส่งชำระ (เช่น carboxymethyl (CM); — CH2COO-) เพื่อเก็บไว้เป็นของหายาก ในขณะที่กลุ่มที่คิดค่าธรรมเนียมบวกถูกนำมาใช้รักษา anions (เช่น diethylaminoethyl (DEAE) (— CH2CH2NH(CH2CH3)2+) ในส่วนของการทดลองนี้ เราจะสามารถใช้ที่ cation-ถ่าย CM-Sephadex-25 ซึ่งจะแยก lysozyme บวกคิดค่าธรรมเนียมจากโมเลกุลของค่าลบ และเป็นกลางได้อย่างมีประสิทธิภาพหน่วย IIAfter construction of your column is complete, you will allow a specific volume of your sample to infiltrate the column bed. At this point, all of the positively charged macromolecules will interact with the stationary phase while the neutrally and negatively charged molecules will pass through. This is facilitated by washing the column with an eluant, which moves those proteins with relatively low affinity for the matrix through the column faster than those interacting with the matrix. Overall, the affinity of a specific protein for the matrix depends upon the pH of solution as well as the presence of ions capable of competing for matrix binding. The final step in this process is to elute those proteins interacting with the matrix. Elution is generally accomplished in one of two ways (as alluded to in the previous paragraph): (1) either by changing the pH of the mobile phase; or (2) its salt concentration. Recalling that the pH of a solution can affect the overall charge of a molecule in solution, a protein that has an initial positive charge, and interacts with the matrix, can be eluted from the column by an increase in pH. The increase in pH will alter the overall charge of the macromolecule and therefore lower its affinity for the stationary phase causing it to elute from the column. One downside to a pH gradient is the difficulty in controlling it, therefore in our experiment we will utilize a linear salt gradient.
Elution by changing the salt concentration of the mobile phase, and therefore its ionic strength, is a more subtle effect. By starting with a mobile phase of minimal salt concentration, the positively charged lysozyme is preferred by the matrix. However, as the concentration of salt in our buffer is increased, the matrix will begin to decrease its affinity for the lysozyme preferring to interact with the salt. As a result, the lysozyme will begin to elute from the column so that fractions can be collected and assayed in the next series of experiments.

Results (Thai) 2:

หัวภาพ BCH4053L
ปฏิบัติการชีวเคมีคู่มือการใช้งานหน้าแรก | ความเกี่ยวข้อง | พื้นหลัง | วิธี | PRELAB การสกัดและการทำให้บริสุทธิ์ของ Lysozyme จากไข่ไก่ - พื้นหลังประกอบด้วยการทดลองต่างๆที่ดำเนินการในช่วงหลายสัปดาห์ที่ผ่านมาการทดลองเริ่มต้นในการพัฒนาการไลโซไซม์จะทุ่มเทให้กับการสกัดโปรตีนของผ่านการฟอกเลือดและการทำให้บริสุทธิ์โดยโคแลกเปลี่ยนไอออน. ไม่ว่าจะหมายถึงการฟอกไตในความหมายทางการแพทย์หรือทางชีวเคมีกระบวนการทั้งขึ้นอยู่กับการแพร่กระจายของอนุภาคตัวถูกละลาย มุ่งเน้นไปที่เทคนิคทางชีวเคมีกระบวนการนี้จะประสบความสำเร็จมักจะแก้ปัญหาโดยการแยกที่น่าสนใจภายในท่อล้างไตกึ่งซึมเข้าไปแล้ววางไว้ทั้งในน้ำบริสุทธิ์หรือบัฟเฟอร์โดยเฉพาะอย่างยิ่ง เมื่อเวลาผ่านไปอนุภาคตัวถูกละลายขนาดเล็กโมเลกุลที่มีเส้นผ่าศูนย์กลางน้อยกว่ารูขุมขนของท่อเช่น H2O และโซเดียมคลอไรด์ที่จะผ่านการผ่านเยื่อหุ้มเซลล์ในทิศทางของการลดความเข้มข้นและการเข้าถึงความสมดุลในขณะที่อนุภาคขนาดใหญ่เช่นดีเอ็นเอโปรตีนและ polysaccharides จะถูกเก็บไว้เป็น แสดงในรูป แม้ว่าเทคนิคนี้ไม่สามารถที่จะแยกแยะความแตกต่างระหว่างโมเลกุลจะเป็นประโยชน์โดยเฉพาะอย่างยิ่งในการแยกโมเลกุลขนาดใหญ่จากคนเล็ก นอกจากนี้เนื่องจากความสามารถของอนุภาคตัวถูกละลายที่มีขนาดเล็กได้อย่างอิสระย้ายเข้าและออกของกลางรอบฟอกไตสามารถทำซ้ำเพื่อให้ตัวทำละลายเดิมอาจถูกแทนที่ด้วยสื่อที่แตกต่างกันอย่างสิ้นเชิง. ไตผมพร้อมกับการเพิ่มขึ้นของเอนโทรปีการแพร่กระจายของอนุภาคตัวถูกละลายลงไล่ระดับความเข้มข้น (เช่นจากภูมิภาคของความเข้มข้นที่สูงขึ้นให้เป็นหนึ่งในความเข้มข้นต่ำกว่า) เป็นอย่างดี thermodynamically ยังคงมีการแพร่กระจายเป็นกระบวนการแบบสุ่มสมบูรณ์และทำให้ขึ้นอยู่กับตารางของระยะทางโมเลกุลตัวถูกละลายจะต้องกระจายที่ ตัวอย่างเช่นถ้าโดยเฉลี่ยจะใช้เวลาหนึ่งที่สองสำหรับโมเลกุลตัวถูกละลายเพื่อกระจายเพียงหนึ่งเซนติเมตรที่อนุภาคเดียวกันจะใช้เวลา 25 วินาทีเพื่อกระจาย 5 ซม. แพร่นอกจากนี้ยังมีผลกระทบจากการแก้ปัญหาความหนืดของอนุภาคตัวถูกละลายในสื่อความหนืดสูงจะแสดงอัตราการแพร่กระจายช้ากว่าอนุภาคที่เหมือนกันในสื่อที่มีความหนืดต่ำ. Lysozyme เป็นประจุบวกโปรตีนพื้นฐานภายใต้ค่า pH เป็นกลางพอสมควร เพื่อที่จะรักษาลักษณะนี้ได้โคแลกเปลี่ยนไอออนเราจะ dialyze กับ tris (hydroxymethyl) aminomethane (ทริส) บัฟเฟอร์ บัฟเฟอร์ที่มีประสิทธิภาพในช่วง pH ของ ~ 6.5-9.7 ที่ทริสเป็นบัฟเฟอร์ที่ใช้กันมากที่สุดในการวิจัยทางชีววิทยาเพราะมันเป็นเพียงสารที่มีราคาไม่แพง pKa อยู่ในช่วง pH ด่างเล็กน้อย ส่วนใหญ่ของเอมีนหลักมีค่า pKa มากกว่า 9.0 แต่เนื่องจากการใช้พลังงานอิเล็กตรอนถอนตัวที่แข็งแกร่งของทั้งสามกลุ่มไฮดรอกอยู่บน substitutents เมทิลีนทริสที่ pKa ของบัฟเฟอร์นี้ ~ 8.0 ที่ 25oC และดีที่สุดสำหรับโปรตีนของเรา. ใน ความรู้สึกทั่วไปมากขึ้น dialyzing กับกันชนเป็นประโยชน์สำหรับหลากหลายเหตุผล นอกเหนือจากการควบคุมทั้งความเข้มข้นของเกลือและพีเอชและดังนั้นจึงปกป้องเราจากโปรตีน denaturation, ไตมักจะ preformed กับกันชนที่จะเตรียมความพร้อมสำหรับขั้นตอนต่อไป Dialyzing กับกันชนจึงไม่เพียง แต่เอาเกลือจากการแก้ปัญหาของเราและป้องกันการสูญเสียสภาพธรรมชาติ แต่สถานที่โปรตีนในบัฟเฟอร์ที่จำเป็นสำหรับขั้นตอนต่อไปในการทดลอง. ขั้นตอนสุดท้ายในการสกัดของไลโซไซม์คือการหมุนเหวี่ยง ในระหว่างการฟอกเลือดบางชีววิทยาโมเลกุล (ไขมันคาร์โบไฮเดรตและอื่น ๆ ) จะเกิดการตกตะกอนออกมาของการแก้ปัญหาและถ้าอนุภาคเหล่านี้จะไม่ถูกลบมีโอกาสที่พวกเขาอาจจะยุ่งเกี่ยวกับขั้นตอนต่อไป โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับการทดสอบของเราถ้าตกตะกอนจะไม่ถูกลบออกก่อนที่จะแลกเปลี่ยนไอออนมีโอกาสที่พวกเขาอาจเกิดการอุดตันคอลัมน์และป้องกันไม่ให้เกิดการแยกการทำงานได้อย่างมีประสิทธิภาพจาก ดังนั้นเราจึงต้องหมุนเหวี่ยงตัวอย่างของเราก่อนที่จะมีขั้นตอนนี้เพื่อที่จะขจัดความเสี่ยงที่อาจเกิดขึ้น. เมื่อโมเลกุลของตัวถูกละลายที่มีขนาดเล็กได้ถูกลบออกจากตัวอย่างของเราเราก็สามารถเริ่มต้นที่จะแยกโมเลกุลขนาดใหญ่โดยรูปแบบของโคไอออนแลกเปลี่ยน แลกเปลี่ยนไอออนเป็นเทคนิคที่ใช้ในการแยกชนิดเกือบทั้งหมดของโมเลกุลโปรตีนรวมทั้งค่าใช้จ่ายที่มีขนาดใหญ่นิวคลีโอและแม้กระทั่งกรดอะมิโน หลักการที่อยู่เบื้องหลังเทคนิคนี้จะขึ้นอยู่กับการมีปฏิสัมพันธ์ระหว่าง Coulombic ตัวอย่างและเมทริกซ์ โดยเฉพาะแมทริกซ์ซึ่งเป็นกันมากที่สุดและ cellulose- agarose ตามเรซินเคลือบด้วยการทำงานเป็นกลุ่มอิออนมีความสามารถในการมีปฏิสัมพันธ์กับโมเลกุลแสดงกลุ่มของค่าใช้จ่ายของฝ่ายตรงข้าม. โดยรวมมีสองประเภทหลักของแลกเปลี่ยนไอออน (1) ไอออนบวก -exchange; และ (2) ไอออนแลกเปลี่ยน ในการแลกเปลี่ยนไอออนบวกเมทริกซ์ที่มีการเคลือบด้วยประจุลบการทำงานเป็นกลุ่ม (เช่นคาร์บอกซี (CM); -CH2COO-) เพื่อที่จะรักษาไพเพอร์ในขณะที่กลุ่มที่มีประจุบวกถูกนำมาใช้ในการรักษาแอนไอออน (เช่น diethylaminoethyl (ดีอีเออี) (-CH2CH2NH ( CH2CH3) 2 +). ในส่วนของการทดลองนี้เราจะใช้แลกเปลี่ยนไอออนบวก-CM-Sephadex-25 มีประสิทธิภาพซึ่งจะแยก lysozyme ประจุบวกจากโมเลกุลของประจุลบและเป็นกลาง. ฟอกเลือดครั้งที่สองหลังจากการก่อสร้างของคอลัมน์ของคุณเสร็จสมบูรณ์คุณจะช่วยให้ปริมาณที่เฉพาะเจาะจงของตัวอย่างของคุณจะแทรกซึมเข้าไปในเตียงคอลัมน์. ณ จุดนี้ทั้งหมดของโมเลกุลประจุบวกจะโต้ตอบกับเฟสขณะที่โมเลกุลกลางและประจุลบจะผ่าน. นี้จะอำนวยความสะดวกโดยการล้างคอลัมน์ กับ eluant ซึ่งย้ายโปรตีนที่มีความสัมพันธ์ที่ค่อนข้างต่ำสำหรับเมทริกซ์ผ่านคอลัมน์เร็วกว่าผู้ที่มีปฏิสัมพันธ์กับเมทริกซ์. โดยรวม, ความสัมพันธ์ของโปรตีนที่เฉพาะเจาะจงสำหรับเมทริกซ์ขึ้นอยู่กับค่า pH ของการแก้ปัญหาเช่นเดียวกับการปรากฏตัวของไอออน ความสามารถในการแข่งขันสำหรับเมทริกซ์ที่มีผลผูกพัน. ขั้นตอนสุดท้ายในกระบวนการนี้คือการชะโปรตีนเหล่านั้นมีปฏิสัมพันธ์กับเมทริกซ์ elution สามารถทำได้โดยทั่วไปในหนึ่งในสองวิธี (ตามที่พูดพาดพิงถึงในวรรคก่อน): (1) ไม่ว่าจะโดยการเปลี่ยนแปลงค่า pH ของเฟสเคลื่อนที่นั้น หรือ (2) ความเข้มข้นของเกลือ เรียกว่าพีเอชของการแก้ปัญหาจะมีผลต่อค่าใช้จ่ายโดยรวมของโมเลกุลในสารละลายโปรตีนที่มีประจุบวกครั้งแรกและมีปฏิสัมพันธ์กับเมทริกซ์ที่สามารถชะจากคอลัมน์โดยการเพิ่มขึ้นของค่า pH การเพิ่มขึ้นของค่า pH จะเปลี่ยนค่าใช้จ่ายโดยรวมของโมเลกุลและดังนั้นจึงลดความสัมพันธ์สำหรับเฟสก่อให้เกิดการชะจากคอลัมน์ หนึ่งในข้อเสียในการไล่ระดับค่า pH เป็นความยากลำบากในการควบคุมมันดังนั้นในการทดลองของเราที่เราจะใช้เกลือลาดเชิงเส้น. ชะโดยการเปลี่ยนความเข้มข้นของเกลือของเฟสเคลื่อนที่และอิออนจึงมีความแข็งแรงของมันคือผลที่ลึกซึ้งยิ่งขึ้น โดยเริ่มต้นด้วยเฟสเคลื่อนที่ของความเข้มข้นของเกลือน้อยที่สุด lysozyme ประจุบวกเป็นที่ต้องการของเมทริกซ์ อย่างไรก็ตามในขณะที่ความเข้มข้นของเกลือในบัฟเฟอร์ของเราจะเพิ่มขึ้น, เมทริกซ์จะเริ่มต้นที่จะลดความสัมพันธ์สำหรับ lysozyme เลือกที่จะมีปฏิสัมพันธ์กับเกลือ ในฐานะที่เป็นผลให้ไลโซไซม์จะเริ่มชะจากคอลัมน์เพื่อให้เศษส่วนสามารถเก็บรวบรวมและ assayed ในชุดต่อไปของการทดลอง

Results (Thai) 3:

ภาพส่วนหัว bch4053l ห้องปฏิบัติการชีวเคมีคู่มือ

บ้าน | ความเกี่ยวข้อง | พื้นหลัง | ขั้นตอน | prelab



การสกัดและการทำให้บริสุทธิ์ไลโซไซม์จากไข่ไก่ - พื้นหลัง


ประกอบด้วยการทดลองต่าง ๆ ในช่วงหลายสัปดาห์การทดลองเบื้องต้นในลักษณะไลโซไซม์จะทุ่มเทให้กับการเป็นโปรตีนสกัดบริสุทธิ์โดยผ่านการฟอกไตและไอออนโครมาโทกราฟี .

ไม่ว่าจะหมายถึงไตในแง่ทางการแพทย์หรือทางชีวเคมี ทั้งกระบวนการขึ้นอยู่กับการแพร่กระจายของอนุภาคของตัวถูกละลาย . เน้นเทคนิค ชีวเคมีกระบวนการนี้มักจะเกิดขึ้นโดยการแยกสารละลายที่น่าสนใจภายในกึ่งซึมเข้าท่อไตและวางไว้ใน เดอ บริสุทธิ์น้ำหรือบัฟเฟอร์โดยเฉพาะ เวลาผ่านไป ( อนุภาคขนาดเล็ก โมเลกุลที่มีขนาดน้อยกว่ารูของท่อเช่น H2O และ NaCl จะผ่านข้ามเยื่อในทิศทางที่ลดลงของความเข้มข้นและเข้าสู่สมดุลในขณะที่อนุภาคขนาดใหญ่เช่น DNA , โปรตีนและโพลีแซคคาไรด์ยังคงดังแสดงในรูป ถึงแม้ว่าเทคนิคนี้ไม่สามารถแยกแยะระหว่างโมเลกุลมันเป็นประโยชน์โดยเฉพาะอย่างยิ่งในการแยกโมเลกุลขนาดใหญ่จากเล็กๆ นอกจากนี้เนื่องจากความสามารถของสารละลายอนุภาคขนาดเล็กที่จะย้ายได้อย่างอิสระในและออกของรอบกลางไตสามารถทำซ้ำเพื่อให้ตัวทำละลายเดิมอาจถูกแทนที่ด้วยสื่อที่แตกต่างกันโดยสิ้นเชิง และผม



พร้อม โดยการเพิ่มขึ้นของเอนโทรปี การแพร่กระจายของอนุภาคของตัวถูกละลายลงลาด ( เช่นจากพื้นที่ของความเข้มข้นสูงของความเข้มข้นต่ำ ) เป็นมงคล thermodynamically . แต่การแพร่เป็นกระบวนการแบบสุ่มอย่างสมบูรณ์จึงขึ้นอยู่กับตารางของระยะทางที่สารละลายโมเลกุลจะทำให้กระจาย ตัวอย่างเช่น ถ้าโดยเฉลี่ยใช้เวลาสักครู่เพื่อสกัดโมเลกุล เพื่อกระจายเพียงหนึ่งเซนติเมตร อนุภาคนั้นจะใช้เวลา 25 วินาที เพื่อกระจาย 5-cm .ยังได้รับผลกระทบจากการแพร่ของตัวถูกละลายในสารละลายหนืดเป็นอนุภาคหนืดสูงสื่อจะแสดงอัตราการแพร่ช้ากว่าเดิมอนุภาคในสื่อที่มีความหนืดต่ำ

ไลโซไซม์เป็นประจุบวก โปรตีนพื้นฐานภายใต้ pH เป็นกลางพอสมควร เพื่อรักษาลักษณะนี้ ไอออน chromatography ,เราจะ dialyze กับทริส ( ซี ) การใช้เสียงระดับต่ำ ( ทริส ) กันชน ที่มีประสิทธิภาพมากกว่าบัฟเฟอร์ pH ในช่วง ~ 6.5 9.7 , ทริสบัฟเฟอร์ที่ใช้บ่อยที่สุดในการวิจัยทางชีวภาพ เพราะมันเป็นเพียงราคาไม่แพง ผสมกับความด่างเล็กน้อย ค่า pH ในช่วง . ส่วนใหญ่ของเอมีนปฐมภูมิมีคุณค่า pKa มากกว่า 9.0 ,แต่เนื่องจากการแข็งอำนาจของอิเล็กตรอนถอนสามหมู่ไฮดรอกซิลปัจจุบันใน 4 substitutents ของบริษัท , pKa ของบัฟเฟอร์นี้ ~ 8.0 ที่ 25oc และเหมาะสมที่สุดสำหรับโปรตีนของเรา

ในความรู้สึกทั่วไปมากขึ้น dialyzing กับบัฟเฟอร์เป็นประโยชน์สำหรับความหลากหลายของเหตุผล นอกจากการควบคุมทั้งความเข้มข้นเกลือและความเป็นกรด - ด่างดังนั้นการปกป้องโปรตีนจากการหยุดชั่วคราว ฟอกเลือดมักจะเป็น preformed กับบัฟเฟอร์เพื่อเตรียมพร้อมสำหรับขั้นตอนต่อไป dialyzing กับบัฟเฟอร์จึงไม่เพียง แต่ขจัดเกลือออกจากสารละลายของเราและป้องกันการหยุดชั่วคราว แต่สถานที่โปรตีนในบัฟเฟอร์ที่จำเป็นสำหรับขั้นตอนต่อไปในการทดลอง

ขั้นตอนสุดท้ายในการสกัดของไลโซไซม์คือการปั่นเหวี่ยงระหว่างล้างไต บางทางชีวภาพโมเลกุลลิพิด คาร์โบไฮเดรต ฯลฯ ) จะตกตะกอนจากสารละลาย และถ้าอนุภาคเหล่านี้จะไม่ลบออก มีโอกาส อาจรบกวน ในขั้นตอนต่อไป โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับการทดลองของเรา ถ้าตะกอนจะไม่ถูกลบออกก่อนที่ลูกมีโอกาสที่พวกเขาอาจเกิดการอุดตัน และป้องกันการแยกคอลัมน์จากการทำงานได้อย่างมีประสิทธิภาพดังนั้น เราต้องปั่นเหวี่ยงตัวอย่างของเราก่อนขั้นตอนนี้เพื่อขจัดความเสี่ยงที่อาจเกิดขึ้นใด ๆ .

เมื่อโมเลกุลของตัวทำละลายที่มีขนาดเล็กได้ถูกลบออกจากตัวอย่างของเรา เราสามารถเริ่มต้นการแยกโมเลกุลขนาดใหญ่ โดยรูปแบบของไอออนโครมาโตกราฟี . การแลกเปลี่ยนไอออนเป็นเทคนิคที่ใช้แยกสำหรับเกือบทุกชนิดของประจุโมเลกุลขนาดใหญ่รวมทั้งโปรตีน , nucleotides ,และกรดอะมิโน หลักการที่อยู่เบื้องหลังเทคนิคนี้จะขึ้นอยู่กับการโต้ตอบ coulombic ระหว่างตัวอย่างและเมทริกซ์ โดยเฉพาะ เมทริกซ์ ซึ่งมักมีเซลลูโลสและเคลือบด้วยเรซินที่ใช้ , , การทำงานกลุ่มไอออนสามารถมีปฏิสัมพันธ์กับโมเลกุล ซึ่งกลุ่มของฝ่ายตรงข้ามที่ค่า

โดยรวมแล้วมีสองประเภทหลักของการแลกเปลี่ยนไอออน :