Giant protoplasts of Saccharomyces

Giant protoplasts of Saccharomyces cerevisiae of 10–35 µm in diameter were generated by multi-cell electrofusion.
Thereby two different preparation strategies were evaluated with a focus on size distribution and “patchability”
of electrofused protoplasts. In general, parental protoplasts were suitable for electrofusion 1–12 h after isolation.
The electrophysiological properties of electrofused giant protoplasts could be analyzed by the whole-cell patch
clamp technique. The area-specific membrane capacitance (0.66±0.07 µF/cm2
) and conductance (23–44 µS/cm2
)
of giant protoplasts were consistent with the corresponding data for parental protoplasts. Measurements with
fluorescein-filled patch pipettes allowed to exclude any internal compartmentalisation of giant protoplasts by
plasma membranes, since uniform (diffusion-controlled) dye uptake was only observed in the whole-cell
configuration, but not in the cell-attached formation. The homogeneous structure of giant protoplasts was further
confirmed by the observation that no plasma membrane associated fluorescence was seen in the interior of giant
cells after electrofusion of protoplasts expressing the light-activated cation channel Channelrhodopsin-2 (ChR2)
linked to yellow fluorescent protein (YFP). Patch clamp analysis of the heterologously expressed ChR2-YFP
showed typical blue light dependent, inwardly-directed currents for both electrofused giant and parental
protoplasts. Most importantly, neither channel characteristics nor channel expression density was altered by
electric field treatment. Summarising, multi-cell electrofusion increases considerably the absolute number of
membrane proteins accessible in patch clamp experiments, thus presumably providing a convenient tool for the
biophysical investigation of low-signal transporters and channels

Results (Thai) 1:

โปยักษ์ของ Saccharomyces cerevisiae ของ 10 – 35 µm ในเส้นผ่าศูนย์กลางสร้างขึ้น โดยเซลล์หลาย electrofusionจึงมีประเมินกลยุทธ์ต่าง ๆ เตรียมสอง โดยมุ่งเน้นการกระจายขนาดและ "patchability"ของโป electrofused ทั่วไป โปโดยผู้ปกครองถูกเหมาะ electrofusion h 1 – 12 หลังจากที่แยกคุณสมบัติ electrophysiological ของโป electrofused ยักษ์อาจจะวิเคราะห์ โดยโปรแกรมปรับปรุงทั้งเซลล์แคลมป์เทคนิค ความเมมเบรนที่ตั้งเฉพาะ (0.66±0.07 µF/cm2) ความต้านทาน (23-44 µS/cm2)ของโปยักษ์ได้สอดคล้องกับข้อมูลเกี่ยวข้องสำหรับผู้ปกครองโป วัดด้วยpipettes เติม fluorescein แพทช์สามารถแยก compartmentalisation ใด ๆ ภายในของโปยักษ์ด้วยเยื่อหุ้มพลาสมา เนื่องจากดูดซับสีย้อม (ควบคุมแพร่) เป็นรูปแบบเท่าที่สังเกตในเซลล์ทั้งหมดตั้งค่าคอนฟิก แต่ ในการก่อตัวเซลล์แนบไม่ โครงสร้างเหมือนของโปยักษ์ถูกเพิ่มเติมยืนยัน โดยการสังเกตว่า fluorescence พลาสมาเมมเบรนที่เชื่อมโยงไม่ถูกเห็นในภายในของยักษ์Channelrhodopsin-2 (ChR2) ช่องเซลล์หลังจาก electrofusion โปแสดง cation เรียกแสงเชื่อมโยงกับโปรตีนเรืองแสงสีเหลือง (YFP) วิเคราะห์ปรับปรุงแคลมป์ ChR2 แสดง heterologously-YFPพบทั่วไปสีฟ้าอ่อนขึ้น ตรงสองอย่างภายในกระแสสำหรับ electrofused ทั้งสองยักษ์ และผู้ปกครองโป สำคัญที่สุด ไม่มีลักษณะช่องสัญญาณหรือช่องนิพจน์ความหนาแน่นมีการเปลี่ยนแปลงโดยการรักษาสนามไฟฟ้า Electrofusion summarising หลายเซลล์เพิ่มขึ้นอย่างมากแน่นอนจำนวนแคลมป์โปรตีนเมมเบรนเข้าในโปรแกรมทดลอง จึง ให้สันนิษฐานว่าเป็นเครื่องมือที่สะดวกสำหรับการตรวจสอบช่องและสัญญาณต่ำผู้ biophysical

Results (Thai) 3:

ยักษ์ของ Saccharomyces cerevisiae ~ i 10 – 35 µขนาดเส้นผ่าศูนย์กลางถูกสร้างขึ้นโดย electrofusion เซลล์หลาย
จึงแตกต่างกันสองกลยุทธ์การเตรียมประเมินโดยมุ่งเน้นการกระจายขนาดและ " patchability "
ของ electrofused พลาสต์ . โดยทั่วไปพบพ่อแม่ที่เหมาะสมสำหรับ electrofusion 1 – 12 H
หลังจากแยกการศึกษาคุณสมบัติของเอนไซม์ electrofused ยักษ์สามารถวิเคราะห์โดยทั้งเซลล์ปะ
ยึดเทคนิค . พื้นที่เฉพาะแผ่นความจุ ( 0.66 ± 0.07 µ F / cm2
) และความนำ ( 23 – 44 µ S / cm2
)
เลสยักษ์ที่สอดคล้องกับข้อมูลที่สอดคล้องกันเพื่อพบผู้ปกครอง วัดกับ
ี่เต็มปะปิเปตอนุญาตให้ยกเว้นใด ๆภายใน compartmentalisation เลสยักษ์
พลาสมาเมมเบรน เนื่องจากเครื่องแบบ ( ควบคุมการกระจาย ) สีเท่านั้นที่พบในการตั้งค่าเซลล์
ทั้งหมด แต่ไม่ได้อยู่ในเซลล์ที่ก่อตัว โครงสร้างของเอนไซม์ต่อ
ยักษ์เป็นเนื้อเดียวกันยืนยันโดยการสังเกตว่า การเกี่ยวข้องไม่มีเยื่อหุ้มเซลล์ที่เห็นอยู่ภายในเซลล์ยักษ์
หลังจาก electrofusion เลสแสดงแสงใช้งานในช่อง channelrhodopsin-2 ( chr2 )
เชื่อมโยงกับโปรตีนเรืองแสงสีเหลือง ( yfp ) การวิเคราะห์แคลมป์แพทช์ของ heterologously แสดง chr2 yfp
พบโดยทั่วไปขึ้นอยู่กับสีฟ้าอ่อน ,เข้ามากำกับกระแสทั้ง electrofused ยักษ์และพบผู้ปกครอง

ที่สำคัญที่สุด หรือช่อง หรือการแสดงออกลักษณะความหนาแน่นช่องถูกเปลี่ยนแปลงโดย
สนามไฟฟ้าการรักษา สรุปหลายเซลล์ electrofusion เพิ่มขึ้นมากจำนวนแน่นอนของ
เมมเบรนโปรตีนสามารถเข้าถึงได้ใน Patch Clamp การทดลองจึงสันนิษฐานให้เครื่องมือที่สะดวกสำหรับ
การตรวจสอบทางชีวกายภาพของตัวสัญญาณต่ำ และช่อง