Similar hypocotyl samples taken as

Similar hypocotyl samples taken as described above were immediately frozen in liquid nitrogen. They were then processed to obtain cell wall ionically bound peroxidases as described by Lin and Kao [32]. Briefly, 1.2 g apical or basal tissue was homogenized in a cold mortar with pestle along with 1% polyvinyl pyrrolidone in 50 mM phosphate buffer (pH 5.8). The homogenate was centri- fuged at 22 000 g for 15 min and then washed four times with the buffer solution. The first supernatant (FS) was used for the cytosolic protein control. The final pellet was resuspended in 1M NaCl for 2 h at 20 C and finally filtered. This last supernatant (LS) was used to determine cytosolic protein contamination and as protein extract for peroxidase activity.
Cytosolic protein contamination was determined by measuring glucose-6-P-dehydrogenase (EC 1.1.1.49) activity, a cytosolic protein marker as previously described [8]. Two to 15 mg of protein present in FS or LS were used for glucose-6-P-dehydrogenase assay. The reaction mixture contained 100 mM TRIS-HCl buffer (pH 8), 1 mM MgCl2, 0.2 mM NADP and 1 mM Glucose-6-P. Results were expressed as units of Glucose-6-P-dehydrogenase activity (U. g DW 1). One U 1⁄4 nmol of Glucose-6-P metabolized min 1.
Peroxidase activities were determined by measuring the initial rate of the decrease of absorbance at corresponding maxima. Total peroxidase activity was measured using guaiacol as substrate. Reactions containing 20–50 mg of sample protein, 50 mM sodium phosphate buffer (pH 5.8), 11.8 mM H2O2 and 7.2 mM guaiacol were followed spectrophotometrically at 470 nm for 5 min at 30 C (extinction coefficient for tetraguaiacol 1⁄4 26.6 mM 1 cm 1) [51]. Blank was measured without H2O2. Results were expressed as units of total peroxidase activity (U. g DW 1). One U 1⁄4 mmol of tetra- guaiacol min 1. Ferulic acid peroxidase was assayed according to Sa ́nchez et al. [51]. The oxidation of ferulic acid was measured spectrophotometrically following the absorbance decrease at 310 nm in a reaction mixture containing 1.35 mL Na-phosphate buffer (0.2 M, pH 5.8), 0.5 mL ferulic acid (240 mM), 0.5 mL H2O2 (3 mM) and 0.15 mL enzyme extract. One unit of Ferulic acid POD was defined as a decrease of A310 min 1.
NADH oxidation by peroxidases was measured at 340 nm in mixtures containing 50 mM NADH in 30 mM sodium acetate buffer

Results (Thai) 1:

ตัวอย่าง hypocotyl คล้ายถ่ายตามที่อธิบายไว้ข้างต้นได้ทันทีแช่แข็งในไนโตรเจนเหลว พวกเขาถูกประมวลผลแล้วจะได้รับอิสระผูก ionically ผนังเซลล์ตามที่อธิบายไว้ โดย Lin และเมืองเก่า [32] สั้น ๆ เนื้อเยื่อ apical หรือฐาน 1.2 กรัมถูก homogenized ในครกเย็นพร้อมสากพร้อมกับ pyrrolidone โพลีไวนิล 1% ใน 50 มม.ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (pH 5.8) Homogenate เป็น fuged ที่ 22 000 g 15 นาที centri- แล้ว ล้างสี่ครั้ง ด้วยโซลูชันบัฟเฟอร์ Supernatant แรก (FS) ใช้สำหรับควบคุมโปรตีน cytosolic เม็ดสุดท้ายถูก resuspended ใน 1 M NaCl สำหรับ 2h ที่ 20 C และกรองในที่สุด Supernatant นี้ครั้งสุดท้าย (LS) ถูกใช้เพื่อตรวจสอบการปนเปื้อนของโปรตีน cytosolic และเป็นโปรตีนที่แยกสำหรับกิจกรรมฮอสCytosolic โปรตีนปนเปื้อนถูกกำหนด โดยการวัดกิจกรรมกลูโคส-6-P-พร่อง (EC 1.1.1.49) โปรตีน cytosolic เครื่องหมายที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [8] สองถึง 15 มิลลิกรัมโปรตีนอยู่ใน FS หรือ LS ถูกใช้สำหรับการทดสอบกลูโคส-6-P-พร่อง ส่วนผสมของปฏิกิริยาอยู่ 100 mM ทริสเรทติ้ง HCl บัฟเฟอร์ (pH 8), 1 มม. MgCl2, 0.2 mM NADP และ 1 มม.กลูโคส-6-พี ผลลัพธ์ถูกแสดงเป็นหน่วยของกลูโคส-6-P-พร่องกิจกรรม (U. g DW 1) นาโนโมลว่า U หนึ่งของกลูโคส-6-P เผาผลาญนาที 1กิจกรรมฮอสถูกกำหนด โดยการวัดอัตราเริ่มต้นของการลดค่าที่สอดคล้องกันแมก กิจกรรมรวมฮอสถูกวัดโดยใช้ guaiacol เป็นพื้นผิว ปฏิกิริยาที่ประกอบด้วย 20 – 50 มิลลิกรัมของโปรตีนตัวอย่าง 50 มม.โซเดียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (pH 5.8), 11.8 มม. guaiacol H2O2 และ 7.2 มม.ตาม spectrophotometrically ที่ 470 nm สำหรับ 5 นาทีที่ 30 C (ค่าสัมประสิทธิ์การสูญเสีย tetraguaiacol ว่า 26.6 มม. 1 ซม. 1) [51] เปล่าถูกวัด โดย H2O2 ผลลัพธ์ถูกแสดงเป็นหน่วยของกิจกรรมรวมฮอส (U. g DW 1) หนึ่งโมลว่า U นาที tetra guaiacol 1 กรด ferulic ฮอสถูก assayed ตาม Sa ́nchez et al. [51] ออกซิเดชันของกรด ferulic โดยวัด spectrophotometrically ต่อการลดค่าที่ 310 nm ในส่วนผสมปฏิกิริยาที่ประกอบด้วยมล. 1.35 นาฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (0.2 M, pH 5.8), กรด ferulic 0.5 mL (240 มม.), 0.5 mL H2O2 (3 มม.) และเอนไซม์ 0.15 mL สารสกัดจาก กรด Ferulic ฝักหนึ่งหน่วยถูกกำหนดเป็นการลดลงของ A310 นาที 1ออกซิเดชัน NADH โดยอิสระโดยวัดที่ 340 nm ในส่วนผสมที่ประกอบด้วยในบัฟเฟอร์ acetate โซเดียม 30 มม. 50 มม. NADH

Results (Thai) 2:

ตัวอย่าง hypocotyl ที่คล้ายกันดำเนินการตามที่อธิบายไว้ข้างต้นถูกแช่แข็งทันทีในไนโตรเจนเหลว พวกเขาได้รับการประมวลผลแล้วที่จะได้รับของผนังเซลล์ที่ถูกผูกไว้ peroxidases ionically ตามที่อธิบายหลินและเก่า [32] สั้น ๆ , 1.2 กรัมเนื้อเยื่อปลายหรือฐานทำให้เป็นเนื้อเดียวกันในครกกับสากเย็นพร้อมกับโพลีไวนิล pyrrolidone 1% ในขนาด 50 มมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (pH 5.8) homogenate ถูก centri- fuged ที่ 22 000 กรัมเป็นเวลา 15 นาทีแล้วล้างสี่ครั้งด้วยสารละลายบัฟเฟอร์ ใสครั้งแรก (FS) ถูกนำมาใช้สำหรับการควบคุมโปรตีน cytosolic เม็ดสุดท้ายก็ resuspended ใน 1M โซเดียมคลอไรด์เป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่ 20 C และกรองที่สุด นี้สารละลายที่ผ่านมา (LS) ถูกใช้ในการตรวจสอบการปนเปื้อนโปรตีน cytosolic และสารสกัดจากโปรตีนสำหรับกิจกรรม peroxidase
การปนเปื้อนโปรตีน cytosolic ถูกกำหนดโดยการวัดระดับน้ำตาลใน-6-P-dehydrogenase (EC 1.1.1.49) กิจกรรมเครื่องหมายโปรตีน cytosolic อธิบายว่าก่อนหน้านี้ [8] สองถึง 15 มิลลิกรัมของโปรตีนที่อยู่ใน FS หรือ LS ถูกนำมาใช้สำหรับการทดสอบน้ำตาลกลูโคส-6-P-dehydrogenase ผสมปฏิกิริยาที่มีอยู่ 100 มิลลิเมตรทริสเรทติ้ง-HCl บัฟเฟอร์ (pH 8) 1 มิ MgCl2 0.2 มิลลิ NADP และ 1 มิลลิกลูโคส-6-P ผลลัพธ์ที่ได้แสดงเป็นหน่วยงานของกลูโคส-6-P-dehydrogenase กิจกรรม ( U. กรัม DW 1) หนึ่ง U 1/4 nmol กลูโคส-6-P เผาผลาญนาที 1.
กิจกรรมเปอร์ออกซิเดถูกกำหนดโดยการวัดอัตราการเริ่มต้นของการลดลงของการดูดกลืนแสงที่ Maxima ที่สอดคล้องกัน กิจกรรม peroxidase ทั้งหมดถูกวัดโดยใช้ guaiacol เป็นสารตั้งต้น ปฏิกิริยาที่มี 20-50 มิลลิกรัมโปรตีนตัวอย่างขนาด 50 มมบัฟเฟอร์โซเดียมฟอสเฟต (pH 5.8) 11.8 มิลลิ H2O2 และ 7.2 มิลลิ guaiacol ตาม spectrophotometrically ที่ 470 นาโนเมตรเป็นเวลา 5 นาทีวันที่ 30 C (ค่าสัมประสิทธิ์การสูญเสียสำหรับ tetraguaiacol 1/4 26.6 มิลลิ 1 ซม. 1) [51] ก็ว่างเปล่าโดยไม่ต้องวัด H2O2 ผลลัพธ์ที่ได้แสดงเป็นหน่วยของกิจกรรม peroxidase รวม ( U. กรัม DW 1) หนึ่ง U 1/4 มิลลิโมลของ tetra- guaiacol นาที 1. กรด Ferulic peroxidase ได้รับการวิเคราะห์ตาม Sa nchez et al, [51] ออกซิเดชันของกรด ferulic วัด spectrophotometrically ดังต่อไปนี้การลดลงของการดูดกลืนแสงที่ 310 นาโนเมตรในส่วนผสมปฏิกิริยาที่มี 1.35 มลบัฟเฟอร์นาฟอสเฟต (0.2 M ค่า pH 5.8) 0.5 มลกรด ferulic (240 มิลลิเมตร) 0.5 มล H2O2 (3 มิลลิเมตร) และสารสกัดจากเอนไซม์ 0.15 มล หนึ่งหน่วยของกรด Ferulic POD ถูกกำหนดเป็นลดลง A310 นาที 1.
การเกิดออกซิเดชัน NADH โดย peroxidases วัดที่ 340 นาโนเมตรผสมที่มีขนาด 50 มม NADH ใน 30 มิลลิเมตรบัฟเฟอร์โซเดียมอะซิเตท