Biochem. J. (1971) 124, 439-441 439

Biochem. J. (1971) 124, 439-441 439
Printed in Great Britain
Short Communications
Biochemical Studies of the Peroxidase-Mediated Oxidation of Tyrosine to Melanin:
Demonstration of the Hydroxylation of Tyrosine by Plant and Human Peroxidases
By RAVnTDRA P. PATEL and MILTON R. OKUN
Department of Dermatology, Tuft8 Univer8ity School of Medicine and Bo8ton City Hospital,
Boston, Mass. 02118, U.S.A.
and LEON M. EDELSTEIN and DAVID EPSTEIN
Department of Pathology, St Vincent Hospital and University of Massachusetts School of Medicine,
Worcester, Mass. 01610, U.S.A.
(Received 17 June 1971)
The ability of peroxidases to mediate the oxidation
of dopa (3,4-dihydroxyphenylalanine) and
other polyphenols to melanin is known (Maehly &
Chance, 1954; Polis & Schmukler, 1953). However,
it is not generally believed that peroxidases can
mediate the oxidation of tyrosine to melanin. For
this reason mammalian peroxidases have not been
c'onsidered to have roles in the major pathways
involving tyrosine hydroxylation, namely melanin
synthesis and catecholamine synthesis.
Previous histochemical studies in our laboratory
were the first to demonstrate the peroxidasedependent
oxidation of tyrosine (in the presence of
dopa as cofactor) to melanin in mast cells, eosinophils,
melanocytes and neurons (Okun, Edelstein,
Or, Hamada & Donnellan, 1970a,b; Okun et al.
1970c; Okun, Edelstein, Or, Donnellan & Lever,
1971a; Okun et al. 1971b); electrophoretic studies
in our laboratory (Okun et al. 1971b) suggested that
peroxidase, acting alone, could mediate the synthesis
of melanin from tyrosine, since enzymic
conversion of tyrosine into melanin was observed
in peroxidase bands derived from the tissues
studied.
Mason, Onoprienko & Bubler (1957) described
the conversion of tyrosine into dopa by horseradish
peroxidase, with dihydroxyfumarate as factor, but
did not indicate whether further steps in the
tyrosine-to-melanin sequence ensued. Elliott (1932)
described the peroxidatic conversion of tyrosine
into pigment by crude preparations of lactoperoxidase,
but did not identify the pigment or the
pathway of its formation.
No reports were found in the literature on the
quantitative determination of peroxidase-mediated
dopa formnation. In addition, no reports were found
in the literature indicating the ability of purified
preparations of mammalian peroxidase to mediate
the formation of dopa or melanin from tyrosine.
Agner (1941) indicated that myeloperoxidase could
not oxidize tyrosine; however, he did not use dopa
or other cofactor.
Because of our histochemical and electrophoretic
studies, biochemical investigations of the
ability of purified preparations of plant and
mammalian peroxidases to oxidize tyrosine to
melanin were carried out, with either dopa or
dihydroxyfumarate as cofactor. As described
below, these investiagtions confirmed the ability
ofthese enzymes to mediate the synthesis ofmelanin
from tyrosine, and they demonstrated that dopa
and dopachrome are intermediates in this pathway.
Human myeloperoxidase was given by Dr Julius
Schultz, Director of the Papanicolaou Cancer
Research Istitute, Miami, Fla., U.S.A. Horseradish
peroxidase (type II) was purchased from
Sigma Chemical Co., St Louis, Mo., U.S.A. L-Tyrosine,
DL-dopa, sodium ascorbate and dihydroxyfumaric
acid were obtained commerciaUy.
The dopa formed from the hydroxylation of
tyrosine by peroxidase was measured by the
quantitative methods described by Raper (1926)
and Evans & Raper (1937a,b) to demonstrate dopa
formed by the enzymic hydroxylation oftyrosine by
plant tyrosinase. In this method the lead salt of
dopa that is precipitated at alkaline pH is removed
by centrifugation and dopa is recovered by the
action of hydrogen sulphide on this compound.
Our experiments indicated that the peroxidasemediated
synthesis of melanin from tyrosine is
much more rapid than that mediated by mushroom
tyrosinase, with resultant greater difficulty in
identifying dopa as an intermediate. The following
measures were taken to increase the yield of dopa
in the peroxidase-mediated reaction: (a) lowering of
the concentration of enzyme; (b) lowering of the
concentration of cofactor; (c) lowering of the
concentration of hydrogen peroxide; (d) shortening
of the reaction time; (e) use of a reducing agent
(ascorbate).
1.0- as cofactor the absorption peak at 281nm (Fig. 1)
was a measure of newly formed dopa. With dopa
0.9_ as cofactor the net gain in the absorption for dopa
in the reactions mediated by myeloperoxidase and
8
horseradish peroxidase was 0.21 and 0.20 E281
0.8 unit respectively. The absorption peak in the
0/7 -
reaction mediated by myeloperoxidase, with
0.7 ~ / dihydroxyfumarate as cofactor, was 0.44 E281
unit. The average yield of dopa on the basis of
0.6 tyrosine was 3.0%. The low yield was due to the
rapidity of the conversion of dopa into further
E" 0.5- reaction products rather than to a low efficiency of
the hydroxylation of tyrosine. Spectrophotometric
0.4 analysis for tyrosine at the end of the reaction
indicated a consumption of 29.0%.
0.3 In the absence of reducing agent (ascorbate),
dopachrome (peak absorption at 475nm) was
rapidly formed, as a result of the conversion of dopa
0.2 into dopaquinone followed by cyclization of the
dopaquinone. Ultimately the sequence led to the
0.1 - formation of insoluble melanin. The presence of
ascorbate causes dopaquinone to shift back to dopa,
0 ' but does not interfere with the hydroxylation of
340 320 300 280 260 240 220 200 tyrosine (Evans & Raper, 1937b).
Wavelength (nm) Qualitative determination of dopa formed in the
Fig. 1. Spectral curve of dopa derived from the action of reaction was carried out by performing the specific
myeloperoxidase on tyrosine in the presence of dihydroxy- colour reaction described by Arnow (1937). In
fumarate. The absorption peak at 281 nm represents experiments with dihydroxyfumarate as cofactor a
newly formed dopa. copper-red colour confirmed the presence of newly
formed dopa. In experiments with dopa as cofactor
the difference in intensity of this colour
between the control situation and the test solution
In a typical experiment the reaction mixture was visually evident, confirming the presence of
consisted of 4.5mg (25,u.mol) of L-tyrosine dissolved newly formed dopa in the test solution. No reaction
in 9.5ml of 60mM-sodium acetate-acetic acid product was formed without enzyme or with boiled
buffer, pH5.6, 0.25mg (1.25,umol) of DL-dopa dis- enzyme. Omission of hydrogen peroxide or
solved in 0.5 ml of the above buffer, 11.3,ul (10,umol) cofactor resulted in virtually no formation of
of 3.0% hydrogen peroxide, 5.5mg (25.4,tmol) of reaction product.
sodium ascorbate and 0.2mg of myeloperoxidase. In the experiments with dopa as cofactor the
The quantity of enzyme was increased to 2.0mg possibility that the greater amount of dopa present
in the case of horseradish peroxidase. In some in the test experiments was due solely to the
experiments 9.7mg (66,umol) of dihydroxyfumaric retardation of the oxidation of dopa cofactor by
acid dissolved in 9.5ml of 60mM-acetate buffer, competition of tyrosine for the active site on the
pH 5.6, was used as a cofactor instead of dopa. enzyme was excluded by: (a) the increased rate of
The reaction time was 1 h at 25°C. dopachrome formation in the test experiments;
In experiments with dopa as cofactor a control (b) the consumption of tyrosine. There was no
experiment was carried out under the conditions evidence of oxidative polymerization of tyrosine.
described above but with tyrosine omitted. Other Confirmation of the ability of peroxidases to
controls included: (a) omission of enzyme; (b) use hydroxylate tyrosine was provided by the experiof
boiled enzyme; (c) omission of cofactor; (d) ments with dihydroxyfumarate as cofactor.
omission of hydrogen peroxide. Dihydroxyfumarate was also used as cofactor in
The dopa formed by the catalysis of peroxidase histochemical experiments demonstrating perwas
measured spectrophotometrically (Mason, oxidase-dependent oxidation of tyrosine to melanin
1948; Rowbottom, 1954). With dopa as cofactor in granulocytes, mast cells, melanoma cells and
newly synthesized dopa was indicated by the neurons (Okun et al. 1971c).
difference in absorption peaks at 281 nm between Experiments in ourlaboratory (R. Patel, M. Okun,
the curve of the test experiment and the curve of. L. Edelstein & D. Epstein, unpublished work) have
the control experiment. With dihydroxyfumarate shown that the peroxidase-mediated oxidation of
440 R. P. PATEL AND OTHERS 1971
Vol. 124 SHORT COMMUNICATIONS 441
tyrosine to melanin occurs very rapidly at neutral
or slightly alkaline pH.
Biochemical confirmation of the ability of
mammalian peroxidase to mediate the oxidation of
tyrosine to melanin via dopa formation supports
the proposal of Okun et al. (1970a,b,c, 1971a,b) that
peroxidase may have a role in initiating melanin
and catecholamine synthesis in vivo, and in some
instances can alone mediate the synthesis of
melanin and neuromelanin from tyrosine in vivo.
The importance of peroxidase relative to that of
tyrosinase (Duchon, Fitzpatrick & Seiji, 1968) and
tyrosine hydroxylase (Weiner, 1970) in the synthesis
of melanin and catecholamines respectively
remains to be ftully investigated.
This work was supported by U.S. Ptiblic Health Service
Grant Ti AM 5220 and by the St Vincent Hospital
Research Fouindation.
Agner, S. (1941). Acta physiol. scand. 2 (Suppl. 8), 5.
Arnow, J. (1937). J. biol. Chem. 118, 531.
Duchon, J., Fitzpatrick, T. & Seiji, M. (1968). In )Yearbook
of Dermatology, pp. 6-33. Ed. by Kopf, A. &
Andrade, R. Chicago: Yearbook Puiblishers Inc.
Elliott, K. (1932). Biochem. J. 26, 10.
Evans, W. & Raper, H. (1937a). Biochem. J. 31, 2155.
Evans, W. & Raper, H. (1937b). Biochem. J. 31, 2162.
Maehly, A. & Chance, B. (1954). In Methods in Biochemical
Analysis, vol. 1, p. 357. Ed. by Glick, D.
New York, Sydney, London and Toronto: Interscience
Publishers.
Mason, H. (1948). J. biol. Chem. 172

Results (Vietnamese) 1:

Biochem. J. (1971) 124, 439-441 439In ở Vương Quốc AnhNgắn truyền thôngHóa sinh học trung gian Peroxidase oxy hóa của Tyrosine để Melanin:Cuộc biểu tình của Hydroxylation Tyrosine của thực vật và con người PeroxidasesBởi RAVnTDRA P. PATEL và MILTON R. OKUNSở da liễu, Tuft8 Univer8ity trường y khoa và bệnh viện thành phố Bo8tonBoston, Mass 02118, Mỹvà LEON M. EDELSTEIN và DAVID EPSTEINVùng bệnh lý, St Vincent Hospital và trường y đại học MassachusettsWorcester, Mass 01610, Mỹ(Nhận được 17 tháng 6 năm 1971)Khả năng của peroxidases trung gian quá trình oxy hóacủa dopa (3,4-dihydroxyphenylalanine) vàpolyphenol để melanin được biết đến (Maehly &Có thể có, năm 1954; Polis & Schmukler, 1953). Tuy nhiên,nó không nói chung tin rằng peroxidases có thểTrung gian quá trình oxy hóa của tyrosine để melanin. Cholý do này, động vật có vú peroxidases chưac'onsidered có vai trò trong các con đường lớnliên quan đến tyrosine hydroxylation, cụ thể là melaninTổng hợp và catecholamine tổng hợp.Trước histochemical nghiên cứu trong phòng thí nghiệm của chúng tôilà người đầu tiên để chứng minh peroxidasedependentquá trình oxy hóa của tyrosine (trong presence củadopa như cofactor) để melanin trong tế bào mast, bạch cầu ái toan,Melanocytes và tế bào thần kinh (Okun, Edelstein,Hoặc, Hamada & Donnellan, 1970a, b; Okun et al.1970c; Okun, Edelstein, hoặc, Donnellan & đòn bẩy,1971a; Okun et al. 1971b); electrophoretic nghiên cứutrong phòng thí nghiệm của chúng tôi (Okun et al. 1971b) gợi ý rằngperoxidase, hành động một mình, có thể trung gian tổng hợpcủa melanin từ tyrosine, kể từ khi enzymicchuyển đổi tyrosine vào melanin được quan sát thấytrong ban nhạc peroxidase có nguồn gốc từ các mônghiên cứu.Mason, Onoprienko & Bubler (1957) được mô tảchuyển đổi của tyrosine vào dopa bởi cải ngựaperoxidase, với dihydroxyfumarate như là yếu tố, nhưngkhông chỉ ra cho dù tiếp tục bước trong cáctyrosine melanin chuỗi xảy ra sau đó. Elliott (1932)Mô tả chuyển đổi peroxidatic của tyrosinevào sắc tố bởi các chế phẩm thô của lactoperoxidase,nhưng không xác định các sắc tố hoặc cáccon đường của sự hình thành của nó.Không có báo cáo đã được tìm thấy trong các tài liệu trên cácđịnh lượng xác định trung gian peroxidasedopa formnation. Ngoài ra, không có báo cáo đã được tìm thấytrong các tài liệu cho thấy khả năng của tinh khiếtchuẩn bị của động vật có vú peroxidase trung giansự hình thành của dopa hoặc melanin từ tyrosin.Agner (1941) chỉ ra rằng myeloperoxidase có thểôxy hóa tyrosine; Tuy nhiên, ông đã không sử dụng dopahoặc khác cofactor.Bởi vì chúng tôi histochemical và electrophoreticnghiên cứu, các xét nghiệm sinh hóa của cáckhả năng của các chế phẩm tinh khiết của thực vật vàđộng vật có vú peroxidases để ôxi hóa tyrosine đểmelanin được thực hiện, với một trong hai dopa hoặcdihydroxyfumarate như cofactor. Miêu tảdưới đây, các investiagtions xác nhận khả năngcái enzyme trung gian tổng hợp ofmelanintừ tyrosine, và họ đã chứng minh rằng dopavà dopachrome là trung gian trong con đường này.Con người myeloperoxidase đã được đưa ra bởi tiến sĩ JuliusSchultz, giám đốc của ung thư PapanicolaouNghiên cứu Istitute, cải ngựa Miami, Fla, Mỹ.peroxidase (loại II) đã được mua từCông ty hóa chất Sigma, St Louis, MO, Mỹ L-tyrosin,DL-dopa, natri ascorbate và dihydroxyfumaricaxit đã được commerciaUy.Dopa hình thành từ hydroxylation củatyrosine bởi peroxidase được đo bằng cácphương pháp định lượng được mô tả bởi Raper (1926)và Evans & Raper (1937a, b) để chứng minh dopađược thành lập bởi oftyrosine enzymic hydroxylation bởithực vật tyrosinase. Trong phương pháp này dẫn muối củadopa đó kết tủa ở kiềm pH được lấy rabởi số và dopa bị thu hồi bởi cáchành động của hydro sulphide về hợp chất này.Thí nghiệm của chúng tôi chỉ ra rằng peroxidasemediatedTổng hợp của melanin từ tyrosine lànhiều hơn nữa nhanh chóng hơn trung gian của nấmtyrosinase, với kết quả lớn hơn khó khăn trongxác định dopa như là một trung gian. Sau đâybiện pháp đã được thực hiện để tăng năng suất của dopatrong peroxidase trung gian phản ứng: (a) hạnồng độ của các enzym; (b) giảm của cácnồng độ cofactor; (c) giảm của cácnồng độ của hydrogen peroxide; (d) rút ngắnthời gian phản ứng; (e) sử dụng một chất khử(ascorbate).1,0 - như cofactor đỉnh hấp thụ tại 281nm (hình 1)là một biện pháp của mới được thành lập dopa. Với dopa0.9_ như cofactor net đạt được trong sự hấp thu cho dopaphản ứng do trung gian bởi myeloperoxidase và8cải ngựa peroxidase là 0,21 và 0,20 E281cách 0.8 đơn vị tương ứng. Đỉnh cao sự hấp thụ trong các0/7-phản ứng do trung gian bởi myeloperoxidase, với0,7 ~ / dihydroxyfumarate như cofactor, là 0,44 E281đơn vị. Năng suất trung bình là dopa trên cơ sở củacách 0.6 tyrosine là 3,0%. Năng suất thấp là do cácnhanh chóng chuyển đổi dopa vào tiếp tụcE"0,5-phản ứng sản phẩm chứ không phải để một hiệu quả thấp củahydroxylation tyrosin. SpectrophotometricCác phân tích cách 0.4 cho tyrosine ở phần cuối của phản ứngchỉ định một mức tiêu thụ của 29.0%.0.3 trong sự vắng mặt của chất khử (ascorbate),dopachrome (cao điểm hấp thụ lúc 475nm)nhanh chóng thành lập, là kết quả của chuyển đổi dopa0.2 vào dopaquinone theo cyclization của cácdopaquinone. Cuối cùng trình tự đã dẫn đến các0.1 - hình thành của melanin không hòa tan. Sự hiện diện củaascorbate gây ra dopaquinone để thay đổi trở lại để dopa,0' nhưng không can thiệp với hydroxylation của340 320 300 280 260 240 220 200 tyrosin (Evans & Raper, 1937b).Bước sóng (nm) xác định chất lượng dopa hình thành trong cácHình 1. Các đường cong quang phổ của dopa có nguồn gốc từ các hành động của phản ứng được thực hiện bằng cách thực hiện cụ thểmyeloperoxidase trên tyrosine sự hiện diện của phản ứng dihydroxy-màu sắc được mô tả bởi Arnow (1937). Ởfumarat. Đỉnh hấp thụ tại 281 nm đại diện cho thí nghiệm với dihydroxyfumarate như cofactor mộtdopa mới được thành lập. đồng đỏ màu xác nhận sự hiện diện của vừa đượcthành lập dopa. Trong các thí nghiệm với dopa như cofactorsự khác biệt trong cường độ màu sắc nàygiữa tình hình kiểm soát và các giải pháp kiểm traTrong một thử nghiệm điển hình hỗn hợp phản ứng đã trực quan rõ ràng, xác nhận sự hiện diện củabao gồm dopa 4.5mg (25,u.mol) của L-tyrosine giải thể mới được hình thành trong dung dịch thử nghiệm. Không có phản ứngở 9.5ml 60mM-natri sản phẩm axit axetic axetat được thành lập mà không có men tiêu hóa hoặc với đun sôibộ đệm, pH5.6, 0,25 mg (1,25, umol) của DL-dopa dis-enzym. Các thiếu sót của hydrogen peroxide hoặcgiải quyết trong cách 0.5 ml của bộ đệm ở trên, 11.3, ul (10, umol) cofactor dẫn đến hầu như không có sự hình thành củacủa 3,0% hydrogen peroxide, 5,5 mg (25,4, tmol) của sản phẩm phản ứng.Natri ascorbate và cách 0.2mg của myeloperoxidase. Trong các thí nghiệm với dopa như cofactor cácSố lượng các enzym được tăng lên 2,0 mg khả năng mà số tiền lớn của dopa hiện tạitrong trường hợp của cải ngựa peroxidase. Trong một số trong thử nghiệm thí nghiệm là do chỉ duy nhất để cácthí nghiệm 9.7mg (66, umol) của dihydroxyfumaric chậm phát triển của quá trình oxy hóa của dopa cofactor bởiaxít hòa tan trong 9,5 ml của bộ đệm 60mM-axetat, cạnh tranh của tyrosine cho hoạt động trên cácpH 5.6, được sử dụng như một cofactor thay vì dopa. enzyme được ghi bởi: (a) mức tăng củaThe reaction time was 1 h at 25°C. dopachrome formation in the test experiments;In experiments with dopa as cofactor a control (b) the consumption of tyrosine. There was noexperiment was carried out under the conditions evidence of oxidative polymerization of tyrosine.described above but with tyrosine omitted. Other Confirmation of the ability of peroxidases tocontrols included: (a) omission of enzyme; (b) use hydroxylate tyrosine was provided by the experiofboiled enzyme; (c) omission of cofactor; (d) ments with dihydroxyfumarate as cofactor.omission of hydrogen peroxide. Dihydroxyfumarate was also used as cofactor inThe dopa formed by the catalysis of peroxidase histochemical experiments demonstrating perwasmeasured spectrophotometrically (Mason, oxidase-dependent oxidation of tyrosine to melanin1948; Rowbottom, 1954). With dopa as cofactor in granulocytes, mast cells, melanoma cells andnewly synthesized dopa was indicated by the neurons (Okun et al. 1971c).difference in absorption peaks at 281 nm between Experiments in ourlaboratory (R. Patel, M. Okun,the curve of the test experiment and the curve of. L. Edelstein & D. Epstein, unpublished work) havethe control experiment. With dihydroxyfumarate shown that the peroxidase-mediated oxidation of440 R. P. PATEL AND OTHERS 1971Vol. 124 SHORT COMMUNICATIONS 441tyrosine to melanin occurs very rapidly at neutralor slightly alkaline pH.Biochemical confirmation of the ability ofmammalian peroxidase to mediate the oxidation oftyrosine to melanin via dopa formation supportsthe proposal of Okun et al. (1970a,b,c, 1971a,b) thatperoxidase may have a role in initiating melaninand catecholamine synthesis in vivo, and in someinstances can alone mediate the synthesis ofmelanin and neuromelanin from tyrosine in vivo.The importance of peroxidase relative to that oftyrosinase (Duchon, Fitzpatrick & Seiji, 1968) andtyrosine hydroxylase (Weiner, 1970) in the synthesisof melanin and catecholamines respectivelyremains to be ftully investigated.This work was supported by U.S. Ptiblic Health ServiceGrant Ti AM 5220 and by the St Vincent HospitalResearch Fouindation.Agner, S. (1941). Acta physiol. scand. 2 (Suppl. 8), 5.Arnow, J. (1937). J. biol. Chem. 118, 531.Duchon, J., Fitzpatrick, T. & Seiji, M. (1968). In )Yearbookof Dermatology, pp. 6-33. Ed. by Kopf, A. &Andrade, R. Chicago: Yearbook Puiblishers Inc.Elliott, K. (1932). Biochem. J. 26, 10.Evans, W. & Raper, H. (1937a). Biochem. J. 31, 2155.Evans, W. & Raper, H. (1937b). Biochem. J. 31, 2162.Maehly, A. & Chance, B. (1954). In Methods in BiochemicalAnalysis, vol. 1, p. 357. Ed. by Glick, D.New York, Sydney, London and Toronto: IntersciencePublishers.Mason, H. (1948). J. biol. Chem. 172

Results (Vietnamese) 2:

Biochem. J. (1971) 124, 439-441 439
In tại Vương quốc Anh
ngắn Truyền thông
Sinh hóa học của peroxidase-trung gian Quá trình oxy hóa của Tyrosine để Melanin:
Trình diễn các hydroxyl của Tyrosine bởi thực vật và con người peroxidaza
By RAVnTDRA P. Patel và MILTON R. Okun
Sở Da liễu, Tuft8 Univer8ity học Y khoa và bệnh viện thành phố Bo8ton,
Boston, Mass. 02118, USA
và Leon M. Edelstein và DAVID Epstein
Sở Pathology, Bệnh viện St Vincent và Đại học Massachusetts School of Medicine,
Worcester, Mass. 01.610 , USA
(nhận ngày 17 tháng 6 năm 1971)
Khả năng của peroxidaza để hòa giải các quá trình oxy hóa
của dopa (3,4-dihydroxyphenylalanine) và
polyphenol khác để melanin được biết đến (Maehly &
Chance, 1954; Polis & Schmukler, 1953). Tuy nhiên,
nó không phải là thường tin rằng peroxidaza có thể
làm trung gian cho quá trình oxy hóa của tyrosine để melanin. Đối với
lý do này peroxidaza động vật có vú đã không được
c'onsidered có vai trò trong những con đường chính
liên quan đến tyrosine hydroxyl hóa, cụ thể là melanin
tổng hợp và tổng hợp catecholamine.
histochemical nghiên cứu trước đó ở trong phòng thí nghiệm của chúng tôi
là những người đầu tiên chứng tỏ peroxidasedependent
quá trình oxy hóa của tyrosine (trong sự hiện diện của
dopa như cofactor) để melanin trong tế bào mast, bạch cầu ái toan,
melanocytes và tế bào thần kinh (Okun, Edelstein,
Hoặc, Hamada & Donnellan, 1970a, b; Okun et al.
1970c; Okun, Edelstein, Hoặc, Donnellan & Lever,
1971a; Okun et al 1971b). nghiên cứu đổi điện
trong phòng thí nghiệm của chúng tôi (Okun et al. 1971b) cho rằng
peroxidase, hành động một mình, có thể làm trung gian cho sự tổng hợp
melanin từ tyrosine, vì enzym
chuyển đổi tyrosine thành melanin được quan sát thấy
trong các ban nhạc peroxidase có nguồn gốc từ các mô
nghiên cứu.
Mason, Onoprienko & Bubler (1957) mô tả
việc chuyển đổi tyrosine thành dopa bởi cải ngựa
peroxidase, với dihydroxyfumarate như yếu tố, nhưng
không cho biết liệu các bước tiếp theo trong
chuỗi tyrosine-to-melanin xảy ra sau đó. Elliott (1932)
mô tả việc chuyển đổi peroxidatic của tyrosine
thành sắc tố bằng các chế phẩm thô của lactoperoxidase,
nhưng không xác định các sắc tố hoặc các
con đường của sự hình thành của nó.
Không có báo cáo đã được tìm thấy trong các tài liệu về
định lượng của peroxidase qua trung gian
dopa formnation. Ngoài ra, không có báo cáo đã được tìm thấy
trong các tài liệu cho thấy khả năng của tinh khiết
chế phẩm từ động vật có vú peroxidase để hòa giải
sự hình thành của melanin dopa hoặc từ tyrosine.
Agner (1941) chỉ ra rằng myeloperoxidase có thể
không bị ôxy hóa tyrosine; Tuy nhiên, ông không sử dụng dopa
hoặc cofactor khác.
Bởi vì chúng tôi histochemical và điện di
nghiên cứu, điều tra sinh hóa của
khả năng của các chế phẩm tinh khiết của thực vật và
động vật có vú peroxidaza để oxy hóa tyrosine để
melanin được thực hiện, với một trong hai dopa hoặc
dihydroxyfumarate như cofactor. Như được mô tả
dưới đây, các investiagtions khẳng định khả năng
ofthese enzyme làm trung gian tổng hợp ofmelanin
từ tyrosine, và họ đã chứng minh rằng dopa
và dopachrome là trung gian trong con đường này.
myeloperoxidase nhân đã được đưa ra bởi Tiến sĩ Julius
Schultz, giám đốc của ung thư Papanicolaou
Istitute Research, Miami , Fla., USA cải ngựa
peroxidase (loại II) đã được mua từ
Sigma Chemical Co., St Louis, Missouri, USA L-Tyrosine,
DL-dopa, sodium ascorbate và dihydroxyfumaric
axit thu được commerciaUy.
Các dopa hình thành từ sự hydroxyl hóa
tyrosine của peroxidase được đo bằng
phương pháp định lượng được mô tả bởi Raper (1926)
và Evans & Raper (1937a, b) chứng tỏ dopa
hình thành bởi sự hydroxyl hóa enzym oftyrosine của
tyrosinase thực vật. Trong phương pháp này, các muối chì của
dopa được kết tủa ở pH kiềm được lấy ra
bằng cách ly tâm và dopa được phục hồi bởi các
hành động của hydrogen sulphide về hợp chất này.
thí nghiệm của chúng tôi chỉ ra rằng peroxidasemediated
tổng hợp melanin từ tyrosine là
nhiều hơn nữa nhanh hơn so với trung gian bởi nấm
tyrosinase, với khó khăn kết quả lớn hơn trong
việc xác định dopa như một trung gian. Sau đây
các biện pháp đã được thực hiện để tăng năng suất của dopa
trong phản ứng peroxidase qua trung gian: (a) hạ thấp
nồng độ của enzyme; (B) hạ thấp
nồng độ của đồng yếu tố; (C) hạ thấp
nồng độ hydrogen peroxide; (D) rút ngắn
thời gian phản ứng; (E) sử dụng một chất khử
(ascorbate).
1.0- như cofactor đỉnh hấp thụ ở 281nm (Fig. 1)
là một biện pháp dopa mới được thành lập. Với dopa
0.9_ như cofactor các lợi ích ròng trong việc hấp thụ cho dopa
trong các phản ứng trung gian bởi myeloperoxidase và
8
cây cải ngựa peroxidase là 0,21 và 0,20 E281
0,8 đơn vị tương ứng. Các đỉnh hấp thụ trong
0/7 -
phản ứng trung gian bởi myeloperoxidase, với
0,7 ~ / dihydroxyfumarate là đồng yếu tố, là 0.44 E281
đơn vị. Năng suất trung bình của dopa trên cơ sở
0.6 tyrosine là 3,0%. Năng suất thấp là do sự
nhanh chóng của việc chuyển đổi dopa vào thêm
E "0.5- sản phẩm phản ứng chứ không phải là một hiệu quả thấp của
các hydroxyl hóa tyrosine. quang phổ
0,4 phân tích cho tyrosine ở cuối của phản ứng
chỉ ra một tiêu thụ 29,0% .
0.3 Trong trường hợp không làm giảm chất (ascorbate),
dopachrome (hấp thụ đỉnh tại 475nm) đã
nhanh chóng được hình thành, như là kết quả của việc chuyển đổi dopa
0.2 vào dopaquinone tiếp theo là tạo vòng của
dopaquinone Cuối cùng trình tự dẫn đến việc.
0,1 - hình thành melanin không hòa tan. Sự hiện diện của
ascorbate gây dopaquinone chuyển trở lại dopa,
0 'nhưng không can thiệp với các hydroxyl hóa
340 320 300 280 260 240 220 200 tyrosine (Evans & Raper, 1937b).
Bước sóng (nm) quyết định tính dopa hình thành trong
Spectral đường cong của dopa bắt nguồn từ những hành động phản ứng Fig. 1. được thực hiện bằng cách thực hiện cụ thể
myeloperoxidase trên tyrosine trong sự hiện diện của phản ứng màu dihydroxy- mô tả bởi Arnow (1937). Trong
fumarate. Các đỉnh hấp thụ ở 281 nm đại diện cho các thí nghiệm với dihydroxyfumarate như cofactor một
dopa mới được thành lập. màu đồng đỏ xác nhận sự hiện diện của mới
dopa hình thành. Trong thí nghiệm với dopa như cofactor
sự khác biệt về cường độ của màu sắc này
giữa tình hình kiểm soát và các giải pháp thử nghiệm
Trong một thí nghiệm điển hình hỗn hợp phản ứng là trực quan rõ ràng, xác nhận sự hiện diện của
gồm 4.5mg (25, u.mol) của L- tyrosine giải thể mới được dopa hình thành trong dung dịch thử. Không có phản ứng
trong 9.5ml các sản phẩm của acid 60mm-sodium acetate-acetic được hình thành mà không có enzyme hoặc luộc với
đệm, pH5.6, 0.25mg (1.25, umol): DL-dopa enzyme tật. Thiếu sót của hydrogen peroxide hoặc
giải quyết trong 0,5 ml của bộ đệm trên, 11.3, ul (10, umol) cofactor dẫn hầu như không có sự hình thành của
3,0% hydrogen peroxide, 5.5mg (25.4, tmol) của phản ứng sản phẩm.
sodium ascorbate và 0.2 mg myeloperoxidase. Trong các thí nghiệm với dopa như cofactor các
Số lượng enzyme được tăng khả năng 2.0mg rằng số tiền lớn của dopa hiện
trong các trường hợp cải ngựa peroxidase. Trong một số trong các thí nghiệm đã chỉ do các
thí nghiệm 9.7mg (66 umol) chậm phát triển dihydroxyfumaric của quá trình oxy hóa của dopa cofactor bởi
axit hòa tan trong 9.5ml dày 60mm-đệm acetate, cạnh tranh của tyrosine cho các trang web đang hoạt động trên các
pH 5.6, đã được sử dụng như một đồng yếu tố thay vì dopa. enzyme đã được loại trừ bằng cách: (a) sự gia tăng tỷ lệ
Thời gian phản ứng là 1 h ở 25 ° C. hình dopachrome trong các thí nghiệm kiểm tra;
Trong thí nghiệm với dopa như cofactor một điều khiển (b) việc tiêu thụ các tyrosine. Có được không
thí nghiệm được thực hiện theo các điều kiện bằng chứng của phản ứng trùng oxy hóa của tyrosine.
mô tả ở trên nhưng với tyrosine bỏ qua. Chứng nhận khác về khả năng của peroxidaza để
điều khiển bao gồm: (a) sự thiếu sót của enzyme; (B) sử dụng tyrosine hydroxylate được cung cấp bởi các experiof
enzyme luộc; (C) thiếu sót của đồng yếu tố; (D) ments với dihydroxyfumarate như cofactor.
thiếu sót của hydrogen peroxide. Dihydroxyfumarate cũng được sử dụng như là đồng yếu tố trong
The dopa hình thành bởi sự xúc tác của peroxidase thí nghiệm chứng minh histochemical perwas
đo spectrophotometrically (Mason, oxidase phụ thuộc vào quá trình oxy hóa của tyrosine để melanin
1948; Rowbottom, 1954). Với dopa là đồng yếu tố trong bạch cầu hạt, tế bào mast, tế bào u ác tính và
dopa mới tổng hợp được chỉ định bởi các tế bào thần kinh (Okun et al. 1971c).
Sự khác biệt ở đỉnh hấp thụ ở 281 nm giữa thí nghiệm ở ourlaboratory (R. Patel, M. Okun,
các đường cong của thí nghiệm kiểm tra và các đường cong của. L. Edelstein & D. Epstein, làm việc không công bố) có
thí nghiệm kiểm soát. Với dihydroxyfumarate chỉ ra rằng quá trình oxy hóa peroxidase qua trung gian của
440 RP Patel VÀ KHÁC 1971
Vol. 124 SHORT TRUYỀN THÔNG 441
tyrosine để melanin xảy ra rất nhanh ở trung tính
pH hoặc kiềm nhẹ.
Biochemical xác nhận về khả năng của
động vật có vú peroxidase để hòa giải các quá trình oxy hóa của
tyrosine để melanin qua hình dopa hỗ trợ
đề nghị của Okun et al. (1970a, b, c, 1971a, b) mà
peroxidase có thể có một vai trò trong việc khởi xướng melanin
và tổng hợp catecholamine trong cơ thể, và trong một số
trường hợp mình có thể hòa giải sự tổng hợp
melanin và neuromelanin từ tyrosine trong cơ thể.
Tầm quan trọng của peroxidase liên quan đến của
tyrosinase (Duchon, Fitzpatrick & Seiji, 1968) và
tyrosine hydroxylase (Weiner, 1970) trong quá trình tổng hợp
melanin và catecholamin tương ứng
vẫn còn để được điều tra ftully.
Công trình này được hỗ trợ bởi Mỹ Dịch vụ Y tế Ptiblic
Grant Ti AM 5220 và bởi St Vincent Bệnh viện
Nghiên cứu Fouindation.
Agner, S. (1941). Acta Physiol. scand. 2 (Suppl. 8), 5.
Arnow, J. (1937). J. Biol. Chem. 118, 531.
Duchon, J., Fitzpatrick, T. & Seiji, M. (1968). Trong) Niên giám
Da liễu, pp. 6-33. Ed. bởi Kopf, A. &
Andrade, R. Chicago: Niên giám Puiblishers Inc.
Elliott, K. (1932). Biochem. J. 26, 10.
Evans, W. & Raper, H. (1937a). Biochem. J. 31, 2155.
Evans, W. & Raper, H. (1937b). Biochem. J. 31, 2162.
Maehly, A. & Chance, B. (1954). Trong phương pháp trong sinh hóa
phân tích, vol. 1, p. 357. Ed. bởi Glick, D.
New York, Sydney, London và Toronto: Interscience
. Nhà xuất bản
Mason, H. (1948). J. Biol. Chem. 172